การตัดและเชื่อมต่อสาย DNA เป็น DNA สายผสมนั้นไม่เพียงพอที่จะสามารถนำไปประยุกต์ใช้ได้ ยังต้องมีวิธีการที่จะสามารถดำรง DNA สายผสมให้คงอยู่ และเพิ่มจำนวนเพื่อใช้ในการศึกษาว่าสาย DNA เหล่านั้นควบคุมการสร้างโปรตีนชนิดใด และศึกษาว่า DNA มียีนอะไรบ้าง สิ่งจำเป็นคือจะต้องเพิ่มจำนวนของ DNA ที่เหมือน ๆ กันนั้น เรียกว่า การโคลน DNA (DNA cloning) และหาก DNA บริเวณดังกล่าวเป็นยีน ก็อาจเรียกว่า การโคลนยีน (gene cloning)
การโคลนยีนคืออะไรและมีวิธีการอย่างไร ?
วิธีการโคลนยีน
2.1 การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย
การโคลนยีนวิธีนี้ อาศัยวิธีการเพิ่มจำนวนชุดของ DNA ในพลาสมิด (plasmid) ของแบคทีเรีย ซึ่งถือว่าเป็น DNA พาหะ (vector) สำหรับการโคลน DNA อย่างหนึ่งในแบคทีเรีย 1 เซลล์ อาจมีพลาสมิด 1 ถึง 300 ชุด เมื่อนำเซลล์แบคทีเรียไปเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวน ชุดของพลาสมิดก็จะเพิ่ม ซึ่งส่วนของ DNA ที่ต้องการที่แทรกไว้ในพลาสมิด ก็จะเพิ่มขึ้นตามด้วย หากส่วนของ DNA ที่แทรกไว้เป็นยีนก็อาจนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป
ภาพการโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิด (ที่มา : สสวท., 2548, หน้า 92)
พลาสมิด คืออะไร ? (อ่านเพิ่มเติม)
พลาสมิดเป็น DNA วงแหวนสายคู่ที่อยู่นอกโครโมโซมของแบคทีเรีย โดยธรรมชาติ อาจมีขนาดตั้งแต่ 1,000-200,000 คู่เบส พบได้ในเซลล์แบคทีเรียหลายชนิด มักมียีนที่ส้รางเอนไซม์ที่จะทำให้แบคทีเรียมีลักษณะเฉพาะ
พลาสมิดที่นิยมใช้ในการโคลนยีน ปัจจุบันได้มีการพัฒนาให้มีขนาดเล็กประมาณ 3,000-4,000 คู่เบส มียีนที่ต้านทานยาปฏิชีวนะ เพื่อใช้เป็นเครื่องหมายในการคัดเลือกเซลล์แบคทีเรียที่มีพลาสมิดและมีตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะที่เหมาะต่อการแทรกสาย DNA ที่ต้องการเพื่อให้เกิดความสะดวกในการโคลนยีน
ภาพพลาสมิด
2.2 การโคลนยีนในหลอดทดลองโดยเทคนิค พอลิเมอเรสเชน รีแอกชัน หรือ พีซีอาร์
ในปัจจุบันสามารถเพิ่มส่วนของ DNA ได้ในหลอดทดลองโดยไม่ต้องอาศับเซลล์ใด ๆ อีกด้วย ในการใช้่เทคนิคนี้ปัจจุบัยอาศัยเครื่องมือที่เรียกว่า เทอร์มอไซเคลอร์ (thermocycler) ซึ่งเป็นเครื่องควบคุมอุณหภูมิให้ปรับเปลี่ยนตามกำหนดเวลาที่ตั้งเอาไว้
เครื่องมือดังกล่าวนำมาใช้ในการโคลนยีนได้อย่างไร
ในการโคลนยีนโดยอาสัยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอกชัน (polymerase chain reaction ; PCR) ต้องอาศัยเอนไซม์ DNA polymerase ชนิดพิเศษที่นำมาจาก BGA ซึ่งสามารถทนร้อนซึ่งขึ้นอยู่ในน้ำพุร้อน
ปฏิกิริยาในหลอดทดลองต้องใช้อะไรบ้าง ?
1. DNA แม่แบบ ซึ่งเป็นส่วนของ DNA ที่ต้องการโคลน
2. ไพรเมอร์ (primer) เป็นสายสั้น ๆ ที่จะเกาะกับส่วนของ DNA ที่ต้องการ เพื่อเป็นจุดเริ่มต้นของการสร้างสาย DNA
3. นิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิด
4. DNA polymerase
2. ไพรเมอร์ (primer) เป็นสายสั้น ๆ ที่จะเกาะกับส่วนของ DNA ที่ต้องการ เพื่อเป็นจุดเริ่มต้นของการสร้างสาย DNA
3. นิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิด
4. DNA polymerase
สารทั้งหมดนี้จะละลายอยู่ในสารละลายบัฟเฟอร์ เพื่อควบคุมให้เกิดภาวะที่เหมาะสมต่อการเกิดปฏิกิริยา การเกิดปฏิกิริยาในหลอดทดลองจะเริ่มจากการเพิ่มอุณหภูมิให้สูง จนสาย DNA แม่แบบที่เป็น DNA สายคู่แยกออกเป็น DNA สายเดี่ยว จากนั้นจะลดอุณหภูมิลงเพื่อให้เกิดการจับกันระหว่างไพรเมอร์ และสาย DNA แม่่แบบด้วยพันธะไฮโดรเจน จากนั้นปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA polymerase เพื่อให้เกิดการจำลองสาย DNA โดยอาศัยสาย DNA แม่แบบ จากนั้นเพิ่มอุณหภูมิให้สูงขึ้นอีกครั้งเพื่อแยก DNA สายคู่ที่เกิดขึ้นในรอบที่ 1 ออกจากกัน แล้วดำเนินกิจกรรมเช่นเดิม ทำเช่นนี้ซ้ำหลาย ๆ รอบ ก็จะได้โมเลกุลของ DNA ที่ต้องการจำนวนมาก
ภาพการโคลนยีนโดยอาศัยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอกชัน
การสร้างสาย DNA โดย polymerase chain reaction ; PCR
การทำให้เกิดปฏิกิริยาใน 1 รอบ มีลำดับขั้นตอนดังนี้
1. เพิ่มอุณหภูมิให้สูง ทำให้ DNA แม่พิมพ์สายคู่แยกออกเป็นสายเดี่ยว
2. ลดอุณหภูมิลง ทำให้ไพรเมอร์จับกับสาย DNA แม่พิมพ์ด้วยพันธะไฮโดรเจน
3. ปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส ทำให้เกิดการจำลองสาย DNA จากสายแม่พิมพ์
4. เพิ่มอุณหภูมิให้สูงขึ้น ทำให้สาย DNA สายคู่ที่เกิดปฏิกิริยารอบที่ 1 แยกออกจากกันดังภาพ
2. ลดอุณหภูมิลง ทำให้ไพรเมอร์จับกับสาย DNA แม่พิมพ์ด้วยพันธะไฮโดรเจน
3. ปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส ทำให้เกิดการจำลองสาย DNA จากสายแม่พิมพ์
4. เพิ่มอุณหภูมิให้สูงขึ้น ทำให้สาย DNA สายคู่ที่เกิดปฏิกิริยารอบที่ 1 แยกออกจากกันดังภาพ
ภาพการสร้างสาย DNA โดย polymerase chain reaction
เทคนิคนี้ สามารถเพิ่มจำนวนโลเลกุล DNA ที่ต้องการจาก DNA แม่แบบปริมาณน้อย ให้มีปริมาณมากขึ้นในเวลาอันรวดเร็ว แต่อย่างไรก็ตามวิธีการนี้ไม่สามารถทดแทนการโคลนยีนโดยอาศัยแบคทีเรียในกรณีที่ต้องการยีนปริมาณมาก รวมทั้งในกรณีที่ต้องการให้ยีนดังกล่าวเกิดการแสดงออก เช่น การสร้างโปรตีนที่ต้องการ นอกจากนี้การเพิ่มจำนวนชุดของ DNA ด้วยวิธีนี้อาจมีความผิดพลาดเกิดขึ้น เนื่องจากเอนไซม์ที่ใช้ในปริกิริยานี้บางชนิดไม่มีการทำงาน อย่างไรก็ตามการนำเทคนิคนี้มาประยุกต์ใช้อย่างกว้างขวาง ตั้งแต่การโคลนยีนของตัวอย่างที่มี DNA ปริมาณน้อยให้มีปริมาณมากพอ แล้วจึงนำมาโคลนโดยอาศััยพลาสมิด เช่น การเพิ่ม DNA จากซากของวอลลี่ แมมมอธ (wolly mammoth) ซึ่งสูญพันธุ์ไปแล้ว แต่ถูกแช่แข็งไว้ที่ไซบีเรียเมื่อสี่หมื่นปีก่อน ทำให้มีโอกาสศึกษาเชิงวิวัฒนาการในสิ่งมีชีวิตที่สูญพันธุ์ไปแล้ว การตรวจสอบ DNA ปริมาณน้อยที่ติดอยู่ตามคราบเลือด เนื้อเยื่อ หรือน้ำอสุจิที่พบในอาชญากรรมต่าง ๆ ซึ่งเป็นประโยชน์ต่กการสืบสวนของกระบวนการยุติธรรม ตลอกจนการตรวจสอบ DNA จากเซลล์เอ็มบริโอในครรภ์ ว่ามีความผิดปกติทางพันธุกรมหรือไม่ รวมทั้งตรวจสอบการติดเชื้อโรคบางชนิด เช่น HIV เป็นต้น
- ยีนที่ได้จากการโคลนนำไปประยุกต์ใช้ประโยชน์ได้อย่างไร ?
- คำตอบ ยีนที่ได้จากการโคลนนำเข้าสู่สิ่งมีชีวิตโดยการถ่ายยีน เมื่อยีนแสดงออกจะทำให้สิ่งมีชีวิตที่ได้รับการถ่ายยีนผลิตสารหรือโปรตีนตามที่ต้องการได้
