การสังเคราะห์ด้วยแสง (Photosynthesis)

สาระการเรียนรู้
1. การค้นคว้าที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสง2. แสงอาทิตย์แหล่งพลังงานการสังเคราะห์ด้วยแสง3. รงควัตถุสำหรับการสังเคราะห์ด้วยแสง (Photosynthetic Pigment)4. ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นในกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสง5. โฟโตเรสไปเรชัน (Photorespiration)6. ปัจจัยบางประการที่มีผลต่ออัตราการสังเคราะห์ด้วยแสง
พืชจะประกอบด้วยหน่วยที่เล็กที่สุดของพืช หน่วยดังกล่าวนี้จะเรียกว่า เซลล์ (cell) ซึ่งจะมีอยู่ทุกส่วนของพืช อาจมีรูปร่างลักษณะที่แตกต่างกันออกไป จากที่นักเรียนเคยศึกษามาแล้วจะเห็นได้ว่าเซลล์สาหร่ายหางกระรอก เซลล์เยื่อหอม และเซลล์ว่านกาบหอยมีรูปร่างและลักษณะบางอย่างที่เหมือนกัน บางอย่างแตกต่างกัน กล่าวคือ เซลล์สาหร่ายหางกระรอกและเซลล์เยื่อหอมมีรูปร่างเป็นช่อง ๆ สี่เหลี่ยมเหมือนกัน แต่เซลล์ว่านกาบหอยมีรูปร่าง 2 แบบ คือแบบช่องคล้ายสี่เหลี่ยม และรูปร่างแบบเมล็ดถั่วซึ่งเรียกว่า เซลล์คุม แต่พืชใต้น้ำจะไม่มีเซลล์คุม เซลล์คุมนี้มีส่วนประกอบที่เหมือนกับเซลล์สาหร่ายหางกระรอกและเซลล์พืชทั่วไป คือ มีคลอโรพลาสต์ซึ่งมองเห็นเป็นเม็ดสีเขียว ๆ เล็ก ๆ จำนวนมากมายภายในเซลล์โดยทั่วไปแล้วเซลล์พืชจะประกอบด้วยส่วนต่าง ๆ ดังต่อไปนี้1. ผนังเซลล์ เป็นส่วนที่อยู่นอกสุดทำหน้าที่สร้างความแข็งแรงให้แก่พืช มีเฉพาะเซลล์พืชเท่านั้น2. เยื่อหุ้มเซลล์ เป็นเยื่อบางๆทำหน้าที่ควบคุมการผ่านเข้าออกของสารบางอย่าง เช่น น้ำ อากาศ อาหาร และสารละลายต่างๆ3. ไซโทพลาสซึม เป็นของเหลวที่มีสีต่างๆปนอยู่ เช่นส่วนประกอบอื่นๆของเซลล์ อาหารซึ่งได้แก่ น้ำตาล ไขมัน โปรตีน และของเสีย4. นิวเครียส เป็นส่วนประกอบที่สำคัญของเซลล์อยู่ในไซโทพลาสซึม มีลักษระค่อนข้างกลม ทำหน้าที่ควบคุมการทำงานของเซลล์ การเจริญเติบโต ตลอดจนการถ่ายทอดพันธุกรรมจากพ่อแม่ไปสู่ลูกหลาน ภายในไซโทพลาสซึมของเซลล์พืชมีส่วนประกอบสำคัญอย่างหนึ่งที่เซลล์สัตว์ไม่มี คือ เม็ดสีที่เรียกว่า คลอโรพลาสต์ เซลล์พืชส่วนใหญ่มีคลอโรพลาสต์แต่เซลล์บางชนิดหรือบางตำแหน่งก็ไม่มีคลอโรพลาสต์

จากการที่นักเรียนเคยศึกษาทดลองใบชบาด่างจะเห็นว่า ใบชบาด่างบริเวณที่เคยเป็นสีเขียวมีแป้ง สังเกตได้จากการที่สารละลายไอโอดีน เปลี่ยนจากสีน้ำตาลเป็นสีม่วงแกมน้ำเงินซึ่งเหมือนกับสีของน้ำแป้งที่เปลี่ยนไปเมื่อถุกกับสารละลายไอโอดีน ส่วนบริเวณที่เป็นสีขาวจะไม่มีแป้ง สังเกตได้จากการที่สารละลายยังคงเป็นสีน้ำตาลเช่นเดิม แป้งที่ทดสอบได้นี้เปลี่ยนมาจากน้ำตาล ซึ่งเป็นสารที่พืชสร้างขึ้นมา เราเรียกการสร้างอาหารของพืชว่า การสังเคราะห์ด้วยแสง (Photosynthesis) อย่างไรก็ตามในกระบวนการสร้างอาหารของพืช สิ่งแรกที่ได้คือน้ำตาลซึ่งจะเปลี่ยนเป็นแป้งและแป้งนี้จะเปลี่ยนกลับเป็นน้ำตาลอีกเมื่อพืชนำไปใช้ในการดำรงชีวิต ในการสังเคราะห์ด้วยแสง นอกจากจะได้น้ำตาลซึ่งเป็นอาหารของพืชแล้วยังมีแก๊ซออกซิเจนและน้ำเกิดขึ้นด้วย นอกจากคลอโรฟิลล์แล้วพืชยังต้องการปัจจัยอย่างอื่นในการสังเคราะห์ด้วยแสงด้วยจากผลการทดลองการสังเคราะห์ด้วยแสง จะเห็นว่าใบผักบุ้งที่ได้รับแสงและส่วนของใบที่ไม่ได้ปิดด้วยกระดาษดำมีแป้งเกิดขึ้นสังเกตได้จากการที่สารละลายไอโอดีนเปลี่ยนจากสีน้ำตาลเป็นสีม่วงแกมน้ำเงินส่วนใบที่ไม่ได้รับแสงและส่วนของใบที่ปิดด้วยกระดาษดำจะไม่มีแป้ง แสดงว่าสิ่งจำเป็นในการสร้างอาหารของพืชคือแสงและใบผักบุ้งที่มาจากถุงที่มีสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ไม่มีแป้งอยู่ เพราะสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ ดูดแก๊ซคาร์บอนไดออกไซด์ไว้หมด แต่ใบผักบุ้งที่มาจากอีกถุงมีแป้งอยู่ แสดงว่าก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์เป็นสิ่งจำเป็นในการสังเคราะห์แสงของพืช
การค้นคว้าที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสง

ฌอง แบบติสท์ แวน เฮลมองท์ (Jean Baptiste Van Helmont)
ในปี พ.ศ. 2191 ( ค.ศ. 1648 )ได้มีการพิมพ์ผลงานของ ฌอง แบบติสท์ แวน เฮลมองท์ (Jean Baptiste Van Helmont) นักวิทยาศาสตร์ชาวเบลเยียม ที่ทำการทดลองอย่างหนึ่งที่น่าสนใจและมีความสำคัญมากทางชีววิทยา โดยปลูกต้นหลิวหนัก 5 ปอนด์ในถังใบใหญ่ที่บรรจุดินซึ่งทำให้แห้งสนิทหนัก 200 ปอนด์แล้วปิดฝาถัง ระหว่างทำการทดลองได้รดน้ำต้นหลิวที่ปลูกไว้ทุกๆ วันด้วยน้ำฝนเป็นระยะเวลา 5 ปี ต้นหลิวเจริญเติบโตขึ้นมาก เมื่อนำต้นหลิวที่ไม่มีดินติดอยู่ที่รากไปชั่งน้ำหนัก ปรากฏว่าต้นหลิวหนัก 169 ปอนด์ 3 ออนซ์ (ตัวเลขนี้ไม่ได้รวมน้ำหนักใบซึ่งร่วงไปแต่ละปี) และเมื่อนำดินในถังไปทำให้แห้งแล้วนำไปชั่งปรากฏว่ามีน้ำหนักน้อยกว่าดินที่ใช้ก่อนทำการทดลองเพียง 2 ออนซ์เท่านั้นแวน เฮลมองท์ ได้สรุปผลการทดลองว่า น้ำหนักของต้นหลิวที่เพิ่มขึ้น มาจาก น้ำ เพียงอย่างเดียวโดยที่เขาไม่ได้นึกถึง ก๊าซในอากาศ ซึ่งมีส่วนเกี่ยวข้องด้วยหรือแม้แต่ดิน ความจริงแล้วน้ำหนักของดินที่หายไปนั้นก็เป็นส่วนที่พืชนำไปใช้ในการดำรงชีวิต และจำเป็นต่อการเจริญเติบโต และมีส่วนทำให้น้ำหนักเพิ่มขึ้นด้วยจากการศึกษาทำให้เราทราบว่า น้ำหนักของต้นหลิวที่เพิ่มขึ้นจากเดิม คือ 5 ปอนด์ มาเป็น 169 ปอนด์ 3 ออนซ์นั้น มาจาก น้ำ (ที่รดหรือจากดิน) คาร์บอนไดออกไซด์ (CO2) จากอากาศ รวมทั้งแร่ธาตุต่าง ๆ ในดินในการทดลองดังกล่าว เหตุที่ต้องปลูกต้นหลิวในถังที่ปิดฝา ก็เพื่อว่าเป็นการป้องกัน มิให้ดินหล่นจากถังหรือป้องกันดินไม่ให้เกิดใหม่ จากการร่วงของใบ(ต้นหลิว)ลงไปในถังหลังจากนี้ก็มีผลงานของนักวิทยาศาสตร์อีกหลายคนที่ทำให้ได้รายละเอียดเกี่ยวกับการสร้างอาหารของพืชมากขึ้น
เฮลมองต์ จึงสรุปว่า การที่ต้นหลิวเจริญเติบโตได้เนื่องจากน้ำที่ลดลงไป ส่วนการที่มวลของดินหายไปเล็กน้อยนั้นเขาคิดว่าเป็นผลเนื่องจากความคลาดเคลื่อนในการทดลอง อย่างไรก็ตามมวลของดินที่ลดลงไปเล็กน้อย น่าจะสรุปได้ว่าพืชใช้สารอะไรบางอย่างในดิน ซึ่งก็คือแร่ธาตุในการเจริญเติบโตด้วย แทนที่จะสรุปว่าเป็นผลจากความคลาดเคลื่อนในการทดลอง แม้ว่าความคิดของเฮลมองต์จะผิดพลาดแต่นับว่าเป็นก้าวสำคัญสำคัญที่จะไปสู่ความรู้เรื่องการสังเคราะห์ด้วยแสง

โจเซฟ พริสต์ลีย์ (Joseph Priestley)
ในปี พ.ศ. 2315 ( ค.ศ. 1772 ) โจเซฟ พริสต์ลีย์ (Joseph Priestley) นักวิทยาศาสตร์ชาวอังกฤษ ได้พิมพ์ผลงานที่ทำการทดลองโดยจ่อเทียนไขไว้ในครอบแก้ว ปรากฏว่าสักครู่เทียนไขก็ดับและเมื่อใส่หนูเข้าไปในครอบแก้วครู่ต่อมาหนูก็ตาย เมื่อนำหนูที่มีชีวิตไปไว้ในครอบแก้วเดิมที่เทียนไขดับปรากฏว่าหนูตายเกือบทันทีและเมื่อจุดเทียนไขแล้วนำไปใส่ในครอบแก้วเดิมที่หนูตายอยู่แล้วปรากฏว่าเทียนไขดับเกือบทันที่อากาศที่หนูหายใจออกมาและอากาศที่ทำให้เทียนไขดับ ในสมัยนั้นเรียกว่า "อากาศเสีย" สิ่งที่สงสัยในยุคนั้นก็คือคนและสัตว์อื่น ๆ เป็นจำนวนมากกำลังหายใจอยู่ตลอดเวลา และยังมีการเผาไหม้สิ่งต่างๆ ถ้าเป็นเช่นนั้นไปเรื่อยๆ ในที่สุดอากาศที่ใช้ในการหายใจหรือช่วยในการลุกไหม้มิถูกทำลายให้หมดไปหรือเขาได้ทดลองนำหนูใส่ไว้ในครอบแก้วเดียวกันกับพืชสีเขียว ปรากฏว่าทั้งพืชและหนูสามารถมีชีวิตอยู่ได้

บังเอิญครั้งหนึ่งพริสต์ลีย์ได้นำเอาพืชสีเขียวใส่ในครอบแก้วที่เคยจุดเทียนไขเอาไว้ก่อนแล้ว อีก 10 วันต่อมา เมื่อจุดเทียนไขในครอบแก้วนั้นใหม่ ปรากฏว่าเทียนไขลุกไหม้อยู่ได้ระยะหนึ่ง โดยไม่ดับทันทีหลายครั้งที่พริสต์ลีย์ได้แบ่งอากาศหลังจากเทียนไขดับแล้วออกเป็น 2 ส่วน นำพืชใส่ไว้ในส่วนหนึ่ง และอีกส่วนหนึ่งใส่แต่แก้วบรรจุน้ำ ทิ้งไว้ระยะหนึ่งจุดเทียนไขอากาศทั้ง 2 ส่วน พบว่าเทียนไขลุกไหม้ได้ระยะหนึ่งในอากาศส่วนแรก แต่จะดับทันทีในอากาศส่วนที่สอง
หลังจากนั้นเขาได้ศึกษาคุณสมบัติของก๊าซและอากาศ และทราบว่า"อากาศดี" ช่วยในการเผาไหม้และการหายในของสัตว์ แต่การหายใจของสัตว์และการเผาไหม้ของเทียนไขทำให้เกิด "อากาศเสีย" พริสต์ลีย์ มิได้ย้ำถึงความสำคัญของส่วนที่มีสีเขียวของพืชในการที่สามารถทำให้อากาศดีขึ้น และ ไม่ได้คำนึงถึงว่า พืชจะมีความสามารถในการทำให้อากาศดีขึ้นได้ก็ต่อเมื่อพืชได้รับ แสงสว่าง เท่านั้น

แจน อินเก็น ฮูซ (Jan Ingen Housz)
ในปี พ.ศ. 2322 ( ค.ศ. 1779 ) แจน อินเก็น ฮูซ (Jan Ingen Housz) นายแพทย์ชาวดัทช์ (ฮอลันดา) ได้พิสูจน์ให้เห็นว่า การทดลองของพริสต์ลีย์จะได้ผลก็ต่อเมื่อพืชได้รับแสงสว่างและเฉพาะส่วนสีเขียวของพืช เท่านั้นที่มีประสิทธิภาพในการเปลี่ยน "อากาศเสีย" ให้เป็น "อากาศดี" คือถ้ามีแสงสว่างพืชสีเขียวสามารถเปลี่ยนก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์เป็นสารอาหารและออกซิเจน
จากความรู้ทางวิชาเคมีซึ่งพัฒนาขึ้นอย่างรวดเร็ว ในระยะใกล้เคียงกับที่พริสต์ลีย์ และ     อินเก็น ฮูซ ทดลองนั้น พบว่าแก๊สที่เกิดจากการลุกไหม้และแก๊สที่เกิดจากการหายใจออกของสัตว์เป็นแก๊สชนิดเดียวกัน คือ คาร์บอนไดออกไซด์ส่วนแก๊สที่ช่วยในการลุกไหม้และใช้ในการหายใจของสัตว์ คือ ออกซิเจน แสดงว่าเมื่อพืชได้รับแสง พืชจะนำแก๊สคาร์บอนไดออกไซด์เข้าไป และปล่อยแก๊สออกซิเจนออกมา
เมื่อปี พ.ศ. 2329 อินเก็น ฮูซ ยังค้นพบเพิ่มเติมอีกว่าพืชเก็บธาตุคาร์บอนไว้ในรูปของสารอินทรีย์อีกด้วย
ในปี พ.ศ. 2343 จูเลียส ซาคส์ และดับบลิว นอปฟ์ นักสรีรวิทยาชาวยุโรป ทดลองปลูกต้นไม้ในสารละลายซึ่งมีแร่ธาตุต่าง ๆ ในปริมาณที่เหมาะสม ปรากฏว่าสารละลายดังกล่าวสามารถทำให้พืชเจริญเติบโตได้ดี ซึ่งวิธีการของซาคส์และนอปฟ์ ได้พัฒนาเป็นเทคนิคใหม่ในเวลาต่อมาคือ เทคนิคการปลูกพืชโดยไม่ใช้ดิน นักเรียนจะเห็นว่าจากการค้นคว้าของนักวิทยาศาสตร์ต่าง ๆ ทำให้ได้ข้อสรุปว่า ความรู้ทางวิทยาศาสตร์จึงอาจมีการเปลี่ยนแปลงได้ ถ้าหากได้มรับการพัฒนาเทคนิคและวิธีการทดลองใหม่ที่ดีกว่า

นิโคลาส ธีโอดอร์ เดอ โซซูร์ (Nicolas Theodore de Soussure) 
ในปี พ.ศ. 2347 นักวิทยาศาสตร์ชาวสวิส ชื่อ นิโคลาส ธีโอดอร์ เดอ โซซูร์ (Nicolas Theodore de Soussure) ได้ทำการทดลองให้เห็นว่าน้ำหนักของพืชที่เพิ่มขึ้นมากกว่าน้ำหนักของแก๊สคาร์บอนไดออกไซด์ที่ได้รับ เขาจึงสรุปว่าน้ำหนักที่เพิ่มขึ้นบางส่วนเป็นน้ำหนักของน้ำที่พืชได้รับ
จากการทดลองโดยการวิเคราะห์ทางเคมีในเวลาต่อมาพบว่าสารอินทรีย์ที่ได้จากการสร้างอาหารของพืช คือ สารประเภทคาร์โบไฮเดรต และจากผลการศึกษาค้นคว้าทดลอง จึงเขียนสรุปกระบวนการสร้างคาร์โบไฮเดรตได้ดังนี้
จากการศึกษาต่อมาค้นพบว่าคาร์โบไฮเดรตที่ได้คือน้ำตาลโดยทั่วไปจะเขียนสูตรของน้ำตาลโมเลกุลเดี่ยวคือน้ำตาลเฮกโซส (C6 H12 O6)แทนคาร์โบไฮเดรต การสร้างคาร์โบไฮเดรตของพืชที่อาศัยแสงดังที่ได้กล่าวมานี้เรียกว่า กระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสง (photosynthesis) พืชใช้น้ำตาลที่ได้จากกระบวนการนี้เป็นวัตถุดิบในการสร้างคาร์โบไฮเดรตรูปอื่น รวมทั้งสารอาหารอื่น ๆ เช่น ไขมัน โปรตีน เป็นต้น และนำไปใช้ในกิจกรรมต่างๆ ของพืช

แวน นีล (Van Niel)
ในปี พ.ศ. 2473 (ค.ศ. 1930) แวน นีล (Van Niel) แห่งมหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ดได้พบว่าแบคทีเรียบางชนิด ( Green sulfur bacteria และ Purple sulfur bacteria ) สามารถสังเคราะห์ด้วยแสงได้โดยไม่ใช้น้ำ แต่ใช้ไฮโดรเจนซัลไฟด์ ( H2S )แทน ผลที่ได้จากการสังเคราะห์ด้วยแสงแทนที่จะได้ออกซิเจนกลับได้ซัลเฟอร์(S)ออกมาแทนที่จะเกิด O2 แสดงว่าซัลเฟอร์เกิดจาการสลายตัวของไฮโดรเจนซัลไฟด์
แวน นีล จึงเสนอสมมุติฐานว่า ในกระบวนการสร้างคาร์โบไฮเดรตของพืชนั้นน่าจะคล้ายคลึงกับการสร้างคาร์โบไฮเดรตของแบคทีเรีย ก็คือในการสังเคราะห์ด้วยแสงของพืชโมเลกุลของน้ำถูกแยกสลายได้ออกซิเจนเป็นอิสระ

ในปี พ.ศ. 2484 สมมุติฐานของ แวน นีล ก็ได้รับการสนับสนุนจากการทดลองของนักวิทยาศาสตร์กลุ่มหนึ่ง โดยใช้สาหร่ายสีเขียวปริมาณเท่ากันใส่ลงในขวดแก้ว 2 ใบ แล้วใส่น้ำและคาร์บอนไดออกไซด์ลงไปในขวดทั้งสองดังนี้
ขวดแรก ใส่คาร์บอนไดออกไซด์ที่มีออกซิเจนปกติ แต่ใส่น้ำซึ่งประกอบด้วยออกซิเจนซึ่งเป็นสารไอโซโทปหนัก คือ H₂¹⁸O
ขวดที่สอง ใส่คาร์บอนไดออกไซด์ที่ประกอบด้วย H182O แต่ใส่น้ำที่มีออกซิเจนปกติแล้วนำขวดทั้งสองไปตั้งไว้ในที่มีแสง
เมื่อสาหร่ายได้รับแสงก็จะให้ออกซิเจนออกมาทั้งสองขวดแต่เมื่อนำออกซิเจนที่เกิดขึ้น มาทดสอบ ปรากฏว่าออกซิเจนจากขวดแรกเท่านั้นเป็น H182O ส่วนจากขวดที่สองเป็นออกซิเจนปกติ จึงสรุปได้ว่า ออกซิเจนที่ได้จากกระบวนการสังเคราะห์แสง มาจากโมเลกุลของน้ำ สมการเคมีของกระบวนการสังเคราะห์แสงซึ่งใช้ออกซิเจนที่เป็นไอโซโทปหนัก ดังนี้

จากสมการจะเห็นได้ว่าออกซิเจนอิสระมาจากน้ำ แต่น้ำ 6 โมเลกุลมีออกซิเจนเพียง 6 อะตอม แต่มีออกซิเจนอิสระถึง 12 อะตอม ต่อมามีการค้นพบว่าในกระบวนการสังเคราะห์แสงมีน้ำเกิดขึ้นด้วย ดังนั้น สมการสังเคราะห์แสงจะเป็น
สมการข้างต้นเป็นการอธิบายในแง่ของหลักการทางเคมี แต่ไม่ได้อธิบายกระบวนการต่างๆที่เกิดขึ้นในการสังเคราะห์แสง ก่อนสิ้นศตวรรษที่ 19 มีความรู้เกี่ยวกับการสังเคราะห์แสงเพียงว่า พืชสามารถสร้างคาร์โบไฮเดรตเมื่อมีแสงสว่าง โดยใช้คาร์บอนไดออกไซด์และน้ำเป็นวัตถุดิบ
โรบิน ฮิลล์ (Robin Hill)
ในปี พ.ศ. 2475 (ค.ศ. 1932)โรบิน ฮิลล์ (Robin Hill) ทำการทดลองผ่านแสงเข้าไปในของผสมซึ่งมีเกลือเฟอริกและคลอโรพลาสต์ที่สกัดออกมาจากผักโขม ปรากฏว่า เกลือเฟอริกเปลี่ยนเป็นเกลือเฟอรัสและมีออกซิเจนเกิดขึ้น แต่ถ้าในของผสมไม่มีเกลือเฟอริกก็จะไม่เกิดแก๊สออกซิเจน
เกลือเฟอริกเปลี่ยนเป็นเกลือเฟอรัสได้ก็เพราะได้รับอิเล็กตรอนจากน้ำซึ่งแตกตัวได้เมื่อมีคลอโรพลาสต์และแสง ขณะเดียวกันก็มีออกซิเจนเกิดขึ้นในปฏิกิริยาด้วย แสดงว่าเกลือเฟอริกทำหน้าที่เป็นตัวออกซิไดส์ (สารที่รับอิเล็กตรอน) ซึ่งจากการค้นคว้าต่อมาพบว่าในพืชมีสารที่ทำหน้าที่เป็นตัวออกซิไดส์หลายชนิด เช่น นิโคตินาไมด์อะดีนีนไดนิวคลีโอไทด์ฟอสเฟต (nicotinamide adenine dinucleotide phosphote) เขียนย่อ ๆ ว่า NADP⁺

จากการทดลองของฮิลล์ สรุปได้ว่าเมื่อคลอโรพลาสต์ได้รับพลังงานจากแสง และมีสารรับอิเล็กตรอนอยู่ด้วย น้ำก็จะแตกตัวให้ออกซิเจนได้โดยไม่จำเป็นต้องมีคาร์บอนไดออกไซด์ การทดลองของฮิลล์ครั้งนี้ก่อให้เกิดการตื่นตัวกันมาก เพราะปฏิกิริยาที่เขาทดลองนี้มีการปลดปล่อยแก๊สออกซิเจนเช่นเดียวกับพืช แต่ในการทดลองของเขาใช้เพียงคลอโรพลาสต์ ซึ่งเป็นออร์แกเนลล์ของเซลล์พืชเท่านั้น จากการทดลองนี้จึงนำไปสู่แนวความคิดว่าปฏิกิริยาการสังเคราะห์ด้วยแสงน่าจะมีอย่างน้อย 2 ขั้นตอนใหญ่ คือ ขั้นที่ปล่อยแก๊สออกซิเจนกับชั้นที่เกี่ยวข้องกับแก๊สคาร์บอนไดออกไซด์
ในปี พ.ศ. 2483 โรบิน ฮิลล์ (Robin Hill) พบว่าปฏิกิริยาดังกล่าวสามารถทำให้เกิดขึ้นได้ในคลอโรพลาสต์ที่แยกออกมาจากเซลล์แล้ว แต่ทั้งนี้จะต้องมีสารชนิดหนึ่ง (A) ซึ่งจะรับอิเล็กตรอนไปจากน้ำ ฮิลล์ เรียกสารนี้ว่า A นี้ว่า ฮิลล์ ออกซิแดนซ์ (Hill oxidant) สาร A เมื่อรับอิเล็กตรอนแล้ว จะอยู่ในสภาพริดิวซ์ (AH₂) ซึ่งเรียกว่า ฮิลล์ รีดักแทนซ์ (Hill reductant) ซึ่งปัจจุบันคือ NADH

แดเนียล อาร์นอน (Daniel Arnon)
ในปี พ.ศ. 2494 (ค.ศ. 1951) แดเนียล อาร์นอน (Daniel Arnon ) และคณะแห่งมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนียที่เบิร์กเลย์ ได้ศึกษารายละเอียดเกี่ยวกับการทดลองของฮิลล์ อาร์นอนคิดว่าถ้าให้สารบางอย่าง เช่น ADP หมู่ฟอสเฟต (Pi) NADP+ และ CO2 ลงไปในคลอโรพลาสต์ที่สกัดมาได้แล้วให้แสงจะมีปฏิกิริยาการสังเคราะห์ด้วยแสงจนได้น้ำตาลเกิดขึ้น
ต่อมาอาร์นอนได้ทำการทดลองเพื่อติดตามขั้นตอนของการเกิดปฏิกิริยา โดยควบคุมปัจจัยบางอย่าง แล้วสังเกตผลการทดลองที่เกิดขึ้น อาร์นอนพบว่าถ้าให้สารต่างๆ ดังที่กล่าวมาแล้วยกเว้นคาร์บอนไดออกไซด์ ปรากฏว่าเกิดปฏิกิริยาเคมีขึ้นได้สารบางอย่างแต่ไม่มีการสร้างคาร์โบไฮเดรต
อาร์นอนได้ทำการทดลองต่อไปอีก โดยให้ปัจจัยต่างๆ ดังที่ได้กล่าวมาแล้วแก่คลอโรพลาสต์ ยกเว้น CO2 และ NADP+ พบว่าเกิด ATP อย่างเดียวเท่านั้น
จากการทดลองนี้แสดงว่าคลอโรพลาสต์ที่ได้รับแสงจะสามารถสร้าง ATP ได้เพียงอย่างเดียวหรือสร้างทั้ง ATP NADPH + H⁺ และ O₂ ก็ได้ ขึ้นอยู่กับว่าคลอโรพลาสต์นั้นจะได้รับ ADP และ Pi เท่านั้น หรือทั้ง NADP+ ADP และ Pi อาจสรุปได้ว่า พืชจะให้ NADPH+H+ และ O₂ เมื่อได้รับ NADP⁺ ต่อมาอาร์นอนได้ทำการทดลองใหม่ โดยเติมแก๊สคาร์บอนไดออกไซด์ ATP และ NADPH + H⁺ ลงไปในสารละลายของคลอโรพลาสต์ที่สกัดออกมาจากเซลล์แต่ ไม่ให้แสงสว่าง ผลปรากฏว่า มีน้ำตาลเกิดขึ้น แสดงว่าปัจจัยในการสังเคราะห์ คือ ATP และ NADPH + H⁺ ไม่ใช่แสง
จากการศึกษาของอาร์นอนทำให้นักวิทยาศาสตร์เกิดแนวคิดว่าขั้นตอนของการสังเคราะห์ด้วยแสงอาจแยกออกเป็น 2 ขั้นตอนใหญ่ ๆ คือ
1. ปฏิกิริยาที่ต้องใช้แสง (Light Reaction)

2. ปฏิกิริยาที่ต้องใช้แสง (Dark Reaction)

ในสมัยแรก ๆ ของการค้นพบเกี่ยวกับการสังเคราะห์ด้วยแสงนั้นเข้าใจว่า แป้ง หรือ น้ำตาลเกิดจากการรวมตัวของคาร์บอนไดออกไซด์และน้ำโดยตรง จนกระทั่งปี พ.ศ. 2448 แบลคแมน (F.F. Blackman) ค้นพบว่า การสังเคราะห์เพื่อสร้างน้ำตาลนั้นเกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาสองปฏิกิริยา คือ ปฏิกิริยาที่ไวต่อแสง (light reaction) และปฏิกิริยาที่ไม่ไวแสง (dark reaction) ปฏิกิริยาแสงนั้นเป็นปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับการสูญเสียอิเล็กตรอนของน้ำ เมื่อได้รับแสงรวมทั้งมีออกซิเจนปฏิกิริยาเกิดขึ้นส่วนปฏิกิริยามืดนั่นเกี่ยวข้องการเปลี่ยนคาร์บอนไดออกไซด์ให้เป็นแป้งและน้ำตาล การเปลี่ยนแปลงดังกล่าวไม่จำเป็นต้องใช้แสงแต่ต้องอาศัยพลังงานจากปฏิกิยาแสง เอ. เบนสัน และ เอ็ม. เคลวิน (A. Benson and M. Calvin) เป็นผู้ศึกษาค้นคว้าเกี่ยวกับปฏิกิริยาจนสามารถเขียนขั้นตอนของปฏิกิริยาได้ ผลงงานนี้ทำให้เขาได้รับรางวัลโนเบลในเวลาต่อมา

2.2 แสงอาทิตย์แหล่งพลังงานการสังเคราะห์ด้วยแสง
แสงเป็นพลังงานชนิดหนึ่งซึ่งประกอบด้วยอนุภาคที่มีขนาดเล็กเป็นจำนวนมากเรียกว่า โปรตอน (proton) หรือ ควันตัม (quantum) ซึ่งมีคุณสมบัติเป็นคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้า (wave of electromagnetic spectrum) ซึ่งมีความยาวคลื่น (wave length) ตั้งแต่ 1x10^-12 เซนติเมตร จนกระทั่งถึงหลายกิโลเมตร แสงอาทิตย์ประกอบด้วยแสงที่มีความยาวคลื่นระหว่าง 225 - 2,500 nm (1 nm=10^-17) อย่างไรก็ตาม แสงอาทิตย์ที่ตกลงมายังพื้นโลกจะมีความยาวคลื่นอยู่ระหว่าง 310 – 2,300 nm ทั้งนี้เนื่องคลื่นสั้นหรือแสงอัลตราไวโอเลตซึ่งเป็นแสงที่มีอันตรายต่อสิ่งมีชีวิตนั้นถูกดูดไว้โดยชั้นของโอโซนในบรรยากาศ ส่วนแสงที่มีความยาวคลื่นมากกว่า 2,300 nm จะถูกดูดไว้โดยไอน้ำและคาร์บอนไดออกไซด์ แสงอาทิตย์ที่ตกลงมาบนพื้นโลกจะมีความยาวคลื่นในช่วงอินฟราเรด ซึ่งไม่สามารถมองเห็นได้ แต่แสงที่มีประโยชน์ต่อการสังเคราะห์ด้วยแสงจะมีความยาวคลื่นอยู่ระหว่าง 380-760 nm ซึ่งเป็นช่วงแสงที่ตาเราสามารถมองเห็นได้ จึงเรียกแสงในช่วงนี้ว่า แสงขาวหรือ วิซิเบิล  ไลต์ (visible light) ซึ่งประกอบด้วยแสงสีต่าง ๆ 7 สี คือ ม่วง คราม น้ำเงิน เขียว เหลือง แสด และแดงแสงสามารถเดินทางได้เร็วมากในสูญญากาศ โดยเดินทางด้วยความเร็ว 186,000 ไมล์/วินาที หรือ 2.99x10¹⁰ เซนติเมตร/วินาที แสงแต่ละชนิดจะเดินทางด้วยความเร็วคงที่เสมอ และเนื่องจากแสงแสดงคุณสมบัติเป็นคลื่น ดังนั้นความยาวคลื่นจึงมีความสัมพันธ์กับความถี่ ดังสมการ

                        V = ^c/_l

            โดยที่     V = ความถี่ของคลื่น

                        C = ความเร็วแสง

                        l = ความยาวคลื่น

เป็นที่ทราบดีกันว่าการที่แสงจะมีบทบาทต่อโมเลกุลของสารใดๆ นั้น จะต้องถูกดูดโดยโมเลกุลของสารนั้นๆ เสียก่อน และการที่แสงซึ่งถูกดูดกลืนนั้นจะมีบทบาทต่อโมเลกุลของสารเพียงใดนั้นย่อมแล้วแต่ระดับพลังงานของแสงแต่ละชนิด เช่น ถ้าโมเลกุลของสารดูดกลืนรังสีคอสมิคหรือรังสีแกมมาหรือรังสีเอกซ์ ซึ่งมีพลังงานสูงมากทำให้พันธะเคมี (chemical bond) ของสารนั้นแตกตัวและอิเล็กตรอนหลุดออกจากโลเลกุลทำให้เกิด รังสีอิสระ (free radical) ขึ้น สำหรับโมเลกุลที่ดูดกลืนรังสีอินฟรา เรด (infra-red) ซึ่งมีพลังงานน้อย จะมีผลเพียงทำให้โมเลกุลสั่นสะเทือน (vibration) หรือเคลื่อนไหว (rotation) เท่านั้น ส่วนแสงช่วงที่ตามองเห็นซึ่งมีความยาวคลื่นระหว่าง 380-760 nm จำทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงระดับพลังงานของอิเล็กตรอน (excitation) ขึ้น นั่นคือระดับพลังงานของอิเล็กตรอนจะเปลี่ยนจากระดับเดิม (ground state) ไปเป็น ระดับที่มีพลังงานสูงขึ้น (excitation energy)  ซึ่งพลังงานที่เกิดขึ้นในเวลาสั้นมาก ในกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสงซึ่งพืชสามารถเปลี่ยนพลังงานแสงให้เป็นพลังงานเคมีได้นั้น เกี่ยวกับการที่พืชนำเอา excitation energy มาใช้ให้เกิดเป็นประโยชน์ โดยที่โมเลกุลของคลอโรฟิลล์ได้รับแสงจะเกิด excitation energy จนทำให้คลอโรฟิลล์สามารถถ่ายทอดอิเล็กตรอนไปยังสารต่าง ๆ ในกระบวนการถ่ายทอดอิเล็กตรอนจนในที่สุด NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) ก็จะถูกรีดิวส์กลายเป็น NADH₂ และพืชจะใช้ NADH₂รีดิวส์คาร์บอนไดออกไซด์ให้เป็นแป้งและน้ำตาล ในทางตรงกันข้ามถ้าคลอโรฟิลล์ไม่สามารถถ่ายทอดอิเล็กตรอนซึ่งอยู่ใสภาพ excited state ไปยังสารอื่น ๆ ได้ ภายในเวลา 10^-9 วินาที อิเล็กตรอนจะกลับคืนมาสู่สภาพเดิม (ground state) โดยที่ excitation energy ที่เกิดขึ้นก่อนแล้วจะต้องมีการเปลี่ยนแปลงไป ซึ่งเปลี่ยนแปลงได้ 2 วิธี คือ สูญเสียไปในรูปแบบความร้อนทั้งหมด หรือสูญเสียไปรูปแบบความร้อนและทำให้เกิดการเรืองแสง (fluorescence) ส่วนหนึ่ง ดังนั้นถ้าเอาสารละลายคลอโรฟิลล์มาส่องด้วยแสง จะเห็นการเรืองแสงของคลอโรฟิลล์เกิดขึ้น แต่ในสภาพธรรมชาติการเรืองแสงของใบไม้ย่อมไม่เกิดขึ้น ไม่ว่าใบไม้จะได้รับแสงชนิดใดก็ตาม ทั้งนี้เพราะใบไม้ย่อมมีสารที่เกี่ยวข้องกับการถ่ายทอดอิเล็กตรอนอยู่อย่างครบครัน ทำให้ใบไม้สามารถเปลี่ยนพลังงานจากแสงแดดมาอยู่ในรูปของพลังงานเคมีได้

2.3 รงควัตถุสำหรับการสังเคราะห์ด้วยแสง (Photosynthetic Pigment)

ในกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสง คลอโรพลาสต์เป็นออร์แกเนลล์ที่ทำหน้าที่นี้จะต้องมีรงควัตถุที่ใช้ในการสังเคราะห์ด้วยแสง ได้แก่ คลอโรฟิลล์ แคโรทีนอยด์ และ ไฟโคบิลิน ในเซลล์โพรทิสต์บางชนิดที่สังเคราะห์ด้วยแสงได้และเซลล์พืชต่างมีรงควัตถุแตกต่างกันออกไปดังตาราง

ตารางที่ 2.1 แสดงรงควัตถุที่ใช้ในกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสงในสิ่งมีชีวิตต่าง ๆ

	คลอโรฟิลล์ a b c d	แคโรทีนอยด์	ไฟโคบิลิน	แบคทีริโอคลอโรฟิลล์ a b c d
แบคทีเรียที่สังเคราะห์	-- -- -- --	+	--	+ -- + +
สาหร่ายสีเขียว	+ -- -- --	+	+	-- -- -- --
สาหร่ายสีแดง	+ -- + --	+	+	+ -- -- --
สาหร่ายสีน้ำตาล	+ -- + --	+	--	-- -- -- --
สาหร่ายสีเขียว	+ + -- --	+	--	-- -- -- --
เฟิน	+ + -- --	+	--	-- -- -- --
พืชมีดอก	++ -- --	+	--	-- -- -- --

จากตารางสรุปได้ว่า1. พืชทุกชนิด จะมีคลอโรฟิลล์ a และ b

2. คลอโรฟิลล์ที่มีอยู่ในพืชและสาหร่ายทุกชนิด คือคลอโรฟิลล์ a

3. รงควัตถุ (pigments) ที่มีอยู่ทั้งในพืช สาหร่าย และแบคทีเรียที่สังเคราะห์ด้วยแสงได้ คือแคโรทีนอยด์ (Carotenoid)

4. รงควัตถุที่พบเฉพาะในสาหร่ายสีแดง และสาหร่ายสีเขียวแกมน้ำเงิน ไม่พบในพืชและสาหร่ายชนิดอื่น คือ ไฟโคบิลิน

5. แบคทีริโอคลอโรฟิลล์ สามารถพบได้ในสาหร่ายสีแดงและแบคทีเรียที่สังเคราะห์ด้วยแสงได้

6. แบคทีเรียที่สังเคราะห์ด้วยแสงได้ จะมีรงควัตถุที่เรียกว่า แบคทีริโอคลอโรฟิลล์ a,c และ d (แบคทีเรียส่วนใหญ่สังเคราะห์ด้วยแสงได้ดีในช่วงคลื่นแสงอินฟราเรด

          คลอโรพลาสต์ (chloroplast)

คลอโรพลาสต์จัดเป็นออร์แกเนลล์ชนิดหนึ่งที่มีความสำคัญต่อพืชและสาหร่าย เนื่องจากเป็นแหล่งที่ใช้สังเคราะห์คาร์โบไฮเดรต ในพืชคลอโรพลาสต์มีลักษณะกลมรี มีความยาวประมาณ 5 ไมโครเมตร กว้าง 2 ไมโครเมตร หนา 1-2 ไมโครเมตร ส่วนคลอโรพลาสต์ในสาหร่ายจะแตกต่างกันทั้งขนาดและรูปร่าง

โครงสร้างของคลอโรพลาสต์
ในเซลล์ของใบแต่ละเซลล์จะมีคลอโรพลาสต์ตั้งแต่จำนวนสิบขึ้นไปถึงจำนวนร้อย ๆ คลอโรพลาสต์ ขึ้นกับชนิดของพืช คลอโรพลาสต์เป็นออร์แกเนลล์มีเยื่อหุ้มขนิดที่เรียกว่า ยูนิกเมมเบรน หรือมีเยื่อ 2 ชั้น เยื่อหุ้มชั้นในจะแผ่เข้าไปข้างในกลายเป็นโครงสร้างย่อยๆที่ประกอบด้วยเยื่อบางๆเรียกว่า ลาเมลลา (lamella) ซึ่งถูกล้อมรอบด้วยของเหลวไม่มีสีเรียกว่า สโตรมา (stroma) ลาเมลลามีลักษณะเป็นแผ่นกลมๆบางๆเรียงซ้อนกันเป็นตั้ง เรียกทั้งตั้งนี้ว่า กรานุม (granum) และลาเมลลาแต่ละแผ่นในกรานุมเรียกว่า ไทลาคอยด์ (Thylakoid)
ในคลอโรพลาสต์เต็มไปด้วยกรานุมที่กระจัดกระจายอยู่ทั่วไป คลอโรพลาสต์ที่เจริญเต็มที่แล้วประกอบด้วยกรานุม 40-60 กรานุม ต่อ 1 คลอโรพลาสต์ ส่วนของลาเมลลาที่เชื่อมระหว่างกรานุม เรียกว่า สโตรมาลาเมลลา (Stroma lamella) หรือ สโตรมาไทลาคอยด์ (stroma thylakoid) ส่วนลาเมลลาหรือไทลาคอยด์ที่ซ้อนกันเป็นตั้งกรานุม เรียกว่า กรานุมไทลาคอยด์ (granum thylakoid) ส่วนของลาเมลลาประกอบด้วยเยื่อหุ้ม 2 ชั้น ซึ่งมีคลอโรฟิลล์และรงควัตถุอื่นๆ เช่น แคโรทีนอยด์ (carotenoids) ติดอยู่บนแผ่นไทลาคอยด์ และมีแกรนูลอยู่เป็นจำนวนมาก ซึ่งมีขนาดแตกต่างกันมาก
สำหรับแกรนูลที่มีขนาดใหญ่ภายในมีกลุ่มของรงควัตถุระบบแสง I และรงควัตถุระบบแสง II แกรนูลเหล่านี้จึงทำหน้าที่รับพลังงานแสง ทำให้อิเล็กตรอนมีพลังงานสูงขึ้น สำหรับแกรนูลขนาดเล็กน่าจะเป็นที่อยู่ของเอนไซม์ชนิดต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการถ่ายทอดอิเล็กตรอนในปฏิกิริยาที่ใช้แสง นั่นคือเยื่อหุ้มลาเมลลาหรือเยื่อหุ้มไทลาคอยด์เป็นที่อยู่ของระบบแสงที่ใช้ในการดูดพลังงานแสง

รงควัตถุสังเคราะห์แสง (Photosynthetic pigment)
รงควัตถุสังเคราะห์ประกอบด้วยรงควัตถุ 3 ชนิด คือ คลอโรฟิลล์ แคโรทีนอยด์ และไฟโคบิลิน แต่ละชนิดก็จะมีบทบาทในการสังเคราะห์ด้วยแสงแตกต่างกัน

คลอโรฟิลล์ (chlorophyll) 
คลอโรฟิลล์ เป็นรงควัตถุที่พบมากในพืชและมีบทบาทต่อการสังเคราะห์ด้วยแสงมากที่สุด มี 4 ชนิด คือ คลอโรฟิลล์เอ บี ซี และดี โดยแต่ละชนิดจะแตกต่างกันที่หมู่ต่าง ๆ ที่ต่อกับวงกลม (side chain) เท่านั้น ความแตกต่างกันของโครงสร้างคลอโรฟิลล์ จะเป็นสาเหตุที่ทำให้ความสามารถในการดูดแสงในช่วงคลื่นต่าง ๆ (absorption spectrum) ของคลอโรฟิลล์แต่ละชนิดไม่เท่ากัน เช่น คลอโรฟิลล์เอ จะดูดแสงได้ดีที่สุดที่ความยาวของช่วงคลื่น 430 และ 662 nm ส่วนคลอโรฟิลล์ บีดูดแสงได้มากที่สุดที่ 453 และ 642 nm คลอโรฟิลล้ป็นสารเคมีที่ไม่ละลายในน้ำแต่ละลายได้ดีในตัวทำละลายอินทรีย์ เช่น อะซีโตนปรีโตเลียมอิเธอร์ ทูโลอิน และแอลกอฮอล์ เป็นต้น อย่างไรก็ตามคลอโรฟิลลืแต่ละชนิดก็สามารถละลายในตัวทำละลายเหล่านี้ได้แตกต่างกัน เช่น คลอโรฟิลล์ เอ ละลายได้ดีในปรีโตเลียมอีเธอร์ ส่วนคลอโรฟิลลื บี จะละลายได้ดีในเมทธิลแอลกอฮอล์ คลอโรฟิลล์พบทั้งในพืชชั้นต่ำและพืชชั้นสูง โดยคลอโรฟิลล์ เอ จะมีอยู่ในพืชสีเขียวทุกชนิด คลอโรฟิลล์ บี จะมีอยู่ในพืชชั้นสูงทุกชนิด นอกจากนี้ยังพบในพืชพวกไบรโอไฟท์ และในสาหร่ายสีเขียว สำหรับคลอโรฟิลล์ ซี และ ดี ไม่ปรากฏอยู่ในพืชชั้นสูงเลย แต่พบในสาหร่ายบางชนิด ดดยคลอโรฟิลล์ ซีจะพบในสาหร่ายสีน้ำตาล ไดอะตอม และไดโนแฟลกเจเลต (dinoflagellates) ส่วนคลอโรฟิลลื ดี จะพบในสาหร่ายสีแดง
ในแบคทีเรีย ที่สามารถสังเคราะห์ด้วยแสงได้ เพราะมีคลอโรฟิลล์แต่เป็นชนิดที่แตกต่างไปจากคลอโรฟิลล์ที่กล่าวมาแล้ว เรียกว่า แบคเทอริโอคลอโรฟิลล์ (bacteriochlorophyll) ที่ดูดแสงได้ดีในช่วงคลื่นอัลตราไวโอเลตและอินฟราเรด คือ ที่ 358 และ 772 nm นอกจากนี้ในแบคทีเรียพวกกำมะถันเขียว (green sulfur bacteria) จะมีคลอโรฟิลล์พวกคลอโรเบียม (chlorobium) ซึ่งดูดแสงช่วงคลื่น 650 และ 660 nm

แคโรทีนอยด์ (carotenoid)
แคโรทีนอยด์ เป็นรงควัตถุที่มีสีเหลือง ส้ม แดง และน้ำตาล โดยทั่วไปจะอยู่ร่วมกับคลอโรฟิลล์ในคลอโรพลาสต์ แต่ในบางกรณีอาจพบอยู่ในที่อื่น ๆ เช่น ในพลาสติด (plastid) อื่น ๆ เช่น โครโมพลาสต์ (chromoplast) ที่พบในหัวแครอท ผลมะเขือเทศและในดอกไม้สีเหลืองบางของพืชชนิด สีของแคโรทีนอยด์จะสังเกตเห็ไนได้ชัดเมื่อปลูกพืชในที่มืด ทั้งนี้เนื่องจากไม่ถุกสีเขียวของคลอโรฟิลล์บังเอาไว้ แสดงว่าการสังเคราะห์แคโรทีนอยด์เป็นกระบวนการที่ไม่เกี่ยวข้องกับแสงในธรรมชาติ แคโรทีนอยด์แบ่งออกได้เป็น 2 ชนิด คือ แคโรทีน (carotene) ซึ่งมีสีแดงกับสีส้มและแซนโทฟิลล์ (xanthophyll) ซึ่งมีสีเหลืองและสีน้ำตาล

ไฟโคบิลิน (phycobilin)
ไฟโคบิลิน เป็นรงควัตถุที่ไม่พบในพืชชั้นสูง แต่จะพบในสาหร่ายสีเขียวแกมน้ำเงินและในสาหร่ายสีแดง

2.4 ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นในกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสง
2.4.1 ปฏิกิริยาที่ใช้แสง
จากการศึกษาของอาร์นอนทำให้นักวิทยาศาสตร์เกิดแนวคิดว่าขั้นตอนของการสังเคราะห์ด้วยแสงอาจแยกออกเป็น 2 ขั้นตอนใหญ่ๆ คือ
- ปฏิกิริยาที่ต้องใช้แสง (Light Reaction)
- ปฏิกิริยาที่ต้องไม่ใช้แสง (Dark Reaction)
ปฏิกิริยาที่ต้องใช้แสง เป็นกระบวนการที่จำเป็นต้องใช้แสงโดยตรงเพื่อทำให้โมเลกุลของน้ำถูกแยกสลาย ซึ่งผลิตภัณฑ์ที่ได้คือ แก็สออกซิเจน ATP และ NADPH+H⁺ ปฏิกิริยาที่ต้องใช้แสง

ปฏิกิริยาในช่วงนี้มีคลอโรพลาสต์มาเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ด้วยแสงด้วยอย่างแน่นอน แต่คลอโรพลาสต์เป็นออร์แกเนลล์ขนาดเล็ก จำเป็นต้องใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนและเทคนิคต่าง ๆ เพื่อศึกษารายละเอียดเกี่ยวกับโครงสร้างและหน้าที่ของคลอโรพลาสต์เพิ่มมากขึ้น
ในการดูดพลังงานแสงกลุ่มรงควัตถุที่รับพลังงานแสงในช่วงคลื่น 700 นาโนเมตร เรียกรงควัตถุกลุ่มนี้ว่า ระบบแสง I (Photosystem I) หรือ P700 ส่วนกลุ่มรงควัตถุที่รับพลังงานแสงในช่วงคลื่น 680 นาโนเมตร เรียกว่า ระบบแสง II (photosystem II) หรือ P680  

สำหรับโมเลกุลของสารต่างๆ ที่ใช้ในปฏิกิริยาที่ใช้แสงนั้นอยู่เฉพาะที่เยื่อหุ้มไทลาคอยด์เท่านั้น จึงทำให้โมเลกุลของสารเหล่านี้ต้องอยู่ติดๆกัน ทำให้ตัวรับอิเล็กตรอนทำการรับอิเล็กตรอนที่หลุดออกมาจากคลอโรฟิลล์ในรงควัตถุระบบแสง I หรือคลอโรฟิลล์ในรงควัตถุระบบแสง II ได้อย่างสมบูรณ์ ระบบแสงทั้งสองนี้จึงทำปฏิกิริยาไปพร้อมๆกัน หรือภายในเวลาใกล้เคียงกัน คือ เมื่อคลอโรฟิลล์ในรงควัตถุระบบแสง I ได้รับพลังงานแสงในช่วงความยาวคลื่นที่พอเหมาะจะกระตุ้นให้อิเล็กตรอนในโมเลกุลของคลอโรฟิลล์มีพลังงานสูงขึ้นจนถึงระดับหนึ่ง ซึ่งอิเล็กตรอนจะหลุดออกไปและจะมีการถ่ายทอดอิเล็กตรอนเกิดขึ้นได้ 2 ลักษณะ คือ

การถ่ายทอดอิเล็กตรอนแบบเป็นวัฏจักร (Cyclic electron transfer)

ในปฏิกิริยาที่ต้องใช้แสงนี้ยังมี cyclic photophosphorylation ซึ่งตัดตอนอยู่ในบางช่วงของ noncyclic photophosphorylation โดยเริ่มจากอิเล็กตรอนในระแบบแสง I แล้ววกเข้าสู่ที่เดิม คือระแบบแสง I ทุกๆสองอิเล็กตรอนที่เข้าสู่การถ่ายทอดอิเล็กตรอน ช่วงนี้จะสร้าง ATP 2 โมเลกุล แต่ไม่มีการสร้าง NADPH+H+ ในช่วงนี้ไม่มีการสลายโมเลกุลของน้ำ ดังนั้น จึงไม่มีการสร้างแก๊สออกซิเจนสำหรับ cyclic photophosphorylation อาจไม่เกิดในสภาพปกติของการสังเคราะห์แสงในพืชทั่วๆไป นักชีววิทยาเชื่อกันว่า กระบวนการนี้น่าจะเกิดกับแบคทีเรียที่สร้าง ATP จากพลังงานแสง

การถ่ายทอดอิเล็กตรอนแบบเป็นวัฏจักร เริ่มจากโมเลกุลของคลอโรฟิลล์ดูดพลังงานแสงไว้ แล้วเกิดการตื่นตัว Z (excited chlorophyll) ยกอิเล็กตรอนให้มีพลังงานสูงขึ้นแล้วหลุดออกไป  จากรงควัตถุระบบแสง 1 (Photosystem I หรือ Photopigment I หรือ P700 ที่เรียกว่า P700 เพราะดูดพลังงานแสงได้ดีที่สุดที่ความยาวคลื่น 700 นาโนเมตร) โดยมีสารเคมีที่เป็นตัวรับอิเล็กตรอน (electron acceptor) มารับอิเล็กตรอนไป สารที่มารับอิเล็กตรอนตัวแรก ซึ่งยังไม่ทราบแน่ชัดว่าเป็นสารใด สมมติว่าเป็นสาร Z เมื่อสาร Z รับอิเล็กตรอนมาแล้วก็จะส่งต่อไปให้สารประกอบที่เป็น electron acceptor ตัวอื่นๆ เช่น

Ferredoxin ----> Cytochrome b ----> Cytochrome f ----> plastocyanin

แล้วกลับมาสู่รงควัตถุระบบแสง 1 ใหม่อีก ขณะที่มีการถ่ายทอดอิเล็กตรอนแบบเป็นวัฏจักรนี้ จะมีการปล่อยพลังงานออกมาเพื่อใช้สร้างสารประกอบ ATP (จาก ADP + Pi) 1 แห่ง (การสร้าง ATP ของช่วงการถ่ายทอดอิเล็กตรอนแบบไม่เป็นวัฏจักรจะเกิดขึ้น 2 แห่ง)

การถ่ายทอดอิเล็กตรอนแบบไม่เป็นวัฏจักร (non cyclic electron transfer)

การถ่ายทอดอิเล็กตรอนแบบไม่เป็นวัฏจักร (non cyclic electron transfer) ในระบบแสง I อิเล็กตรอนในคลอโรฟิลล์ได้รับพลังงานแสง ทำให้อิเล็กตรอนมีพลังงานสูงขึ้น และหลุดออกจากคลอโรฟิลล์ อิเล็กตรอนที่หลุดออกมีพลังงานสูง และถูกถ่ายทอดผ่านตัวรับอิเล็กตรอนไปหลายทอด พร้อมกับพลังงานของอิเล็กตรอนลดลง จนกระทั่งถึงตัวรับอิเล็กตรอนตัวสุดท้ายคือ NADP⁺ ซึ่งจะเปลี่ยนเป็น NADPH + H⁺ อิเล็กตรอนที่สูญหายไปจากระบบแสง I จะได้รับกลับคืนมาจากอิเล็กตรอนของคลอโรฟิลล์ในระบบแสง II เหมือนกับระบบแสง I ระบบแสง II จะถูกกระตุ้นโดยโฟตอน แล้วปล่อยอิเล็กตรอนออกมาสู่ตัวรับอิเล็กตรอนที่ทำหน้าที่รับกันต่อๆอย่างต่อเนื่องในขณะที่พลังงานของอิเล็กตรอนจะลดลงตามลำดับ ในที่สุดจะเข้าสู่รงควัตถุกลุ่ม P700 ซึ่งอยู่ในระบบแสง I แทนอิเล็กตรอนที่สูญเสียไป สำหรับอิเล็กตรอนในโมเลกุลของรงควัตถุในระบบแสง II ที่สูญเสียไปนั้นจะได้คืนมาจากอิเล็กตรอนที่เกิดจากการสลายตัวของน้ำ (photolysis) ในปฏิกิริยาที่ต้องใช้แสง นอกจากการสลายตัวของน้ำจะให้อิเล็กตรอนแล้ว ยังได้ออกซิเจนและโปรตอนจากน้ำอีกด้วย

อิเล็กตรอนที่ได้จากการสลายของน้ำ จะถูกถ่ายทอดผ่านตัวนำอิเล็กตรอนไปสู่ระบบแสง II และระบบแสง I ตามลำดับ และถ่ายทอดไปสู่ NADP⁺ รวมกับโปรตรอน (H⁺) ที่เกิดจากการสลายของน้ำถูกส่งไปยัง NADP+ กลายเป็น NADPH+H⁺ ส่วนออกซิเจนในโมเลกุลของน้ำกลายเป็นแก๊สออกซิเจนเข้าสู่บรรยากาศต่อไป
อิเล็กตรอนที่หลุดออกจากระบบแสง II ส่งผ่านตัวรับอิเล็กตรอนทีละตัวๆ โดยปฏิกิริยาออกซิเดชัน-รีดักชัน อย่างต่อเนื่องในขณะที่พลังงานของอิเล็กตรอนก็ลดลงเรื่อยๆเช่นกัน จนเข้าสู่ระบบแสง I ได้ดี ในบางช่องของการถ่ายทอดอิเล็กตรอนนี้จะมีการนำพลังงานไปสร้างโมเลกุลของ ATP ได้ กระบวนการในช่วงนี้อาจเรียกว่า noncyclic photophosphorylation
เหตุที่เรียกว่าโฟโตฟอสโฟรีเลชัน (photophosphorylation) เพราะอิเล็กตรอนได้รับพลังงานจากโฟตอนของแสง แล้วใช้พลังงานในการสร้าง ATP จาก ADP ซึ่งตรงกับความหมายของ คำว่าโฟโตฟอสโฟรีเลชัน ที่ใช้พลังงานจากแสงสร้าง ATP การที่เป็น noncyclic คือมีการถ่ายทอดอิเล็กตรอนไปในทางเดียว คือจากน้ำไปสู่ NADP⁺ คือ
น้ำ---->ระบบแสง II ------->ระบบแสง I------->NADP⁺
ทุกๆสองอิเล็กตรอนที่เข้าสู่ noncyclic photophosphorylation นั้นจะให้ ATP 2 โมเลกุล และ NADPH + H+ 1 โมเลกุล การทำงานของระบบแสงทั้งสองระบบ มีโมเลกุลของคลอโรฟิลล์ทำหน้าที่เป็นตัวรับโฟตอน เมื่อได้รับการกระตุ้นจากโฟตอนแล้วก็จะเกิดพลังงานถ่ายทอดไปยังคลอโรฟิลล์ โมเลกุลอื่นๆจนถึงศูนย์ปฏิกิริยา (reaction center) อิเล็กตรอนในโมเลกุลของคลอโรฟิลล์ที่อยู่ที่ศูนย์นี้เท่านั้นที่สามารถหลุดออกไปถ่ายทอดอิเล็กตรอนไปให้ตัวรับอิเล็กตรอน

2.4.2 ปฏิกิริยาที่ไม่ใช้แสง (Dark Reaction)
ปฏิกิริยาที่ไม่ใช้แสง เป็นกระบวนการที่ไม่จำเป็นต้องใช้แสงโดยตรง เป็นกระบวนการที่เกิดหลังปฏิกิริยาที่ต้องใช้แสง เพราะจะต้องรับ ATP และNADPH+H⁺ จากปฏิกิริยาที่ใช้แสง และคาร์บอนไดออกไซด์แม้ไม่ได้รับแสงก็เกิดน้ำตาลได้
ปฏิกิริยาที่ไม่ใช้แสง จากการทดลองของนักวิทยาศาสตร์ที่ได้นำสาหร่ายสีเขียวเซลล์เดียวคลอเรลลา (Chlorella) และน้ำใส่ในขวดแก้วที่ทำเพื่อการทดลองนี้ จากนั้นผ่านแสงและ ¹⁴CO₂ ซึ่งอยู่ในรูปของ H₁₄CO^3- เข้าไปในขวดเพื่อให้เกิดการสังเคราะห์ด้วยแสง ด้านล่างของขวดมีลิ้นสำหรับนำน้ำและสาหร่ายออกไปวิเคราะห์ได้เป็นระยะๆ เพื่อตรวจดูสารที่เกิดขึ้นในระยะต่างๆกัน โดยการตรวจดู ¹⁴C ในสารประกอบที่เกิดขึ้นในขวด เมื่อสังเคราะห์ด้วยแสงไปได้ประมาณ 60 วินาที ตรวจสารประกอบแล้วพบ ¹⁴C ในสารประกอบของกรดฟอสโฟกลีเซอริก (phosphoglyceric acid) หรือ PGA ที่มีคาร์บอนอยู่ 3 อะตอมในโมเลกุล แต่มีเพียงอะตอมเดียวเท่านั้นที่เป็น ¹⁴C ส่วนอีก 2 อะตอมเป็นอะตอมของคาร์บอนปกติ ดังนั้น 14C นี้น่าจะมาจาก 14CO2 ซึ่งอยู่ในรูป H₁₄CO^3- ที่ใส่ไปในน้ำ เมื่อนำผลจากการสังเคราะห์ด้วยแสงมาตรวจหลังจากปล่อยให้สังเคราะห์ด้วยแสงแล้ว ประมาณ 60 วินาที จะพบ ¹⁴C  อยู่ในสารประกอบที่มีคาร์บอน 3 อะตอม คาร์บอน 5 อะตอม และคาร์บอน 6 อะตอม เมื่อเพิ่มเวลาสังเคราะห์ด้วยแสงนานขึ้นเป็น 90 วินาที พบว่ามี ¹⁴C  อยู่ในสารประกอบหลายชนิด รวมทั้งน้ำตาลกลูโคสและ ไขมัน
จากการตรวจดูผลครั้งแรก นักวิทยาศาสตร์คิดว่าจะต้องมีสารประกอบที่มีคาร์บอน 2  อะตอม เข้ารวมตัวกับคาร์บอนไดออกไซด์ได้ PGA เกิดขึ้น เมื่อได้ศึกษาค้นคว้าต่อไป ไม่ปรากฏว่าพบสารประกอบที่มีคาร์บอน 2 อะตอมอยู่เลย แต่พบว่ามีสารประกอบน้ำตาลที่มีคาร์บอน 5 อะตอมคือ ไรบูโลส 1,5 บิสฟอสเฟต (ribulost 1,5 bisphosphate) ที่เรียกย่อว่า RuBP เกิดขึ้นอยู่ตลอดเวลา ถึงแม้ว่าจะมีปฏิกิริยาการสังเคราะห์ด้วยแสงเกิดขึ้นนานแล้วก็ตาม ดังนั้น นักวิทยาศาสตร์จึงได้ตั้งสมมติฐานขึ้นว่า RuBP คงจะรวมกับคาร์บอนไดออกไซด์ได้สารประกอบชนิดใหม่ที่มีคาร์บอน 6 อะตอม แต่สารนี้ไม่อยู่ตัว จะสลายตัวเป็นสารประกอบที่มีคาร์บอน 3 อะตอม คือ PGA 2 โมเลกุล
เมื่อนักวิทยาศาสตร์ทำการวัดปริมาณ RuBP และ PGA ซึ่งเกิดขึ้นในกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสงในสภาพที่แตกต่างกัน คือในสภาพที่มีแสงและมี ¹⁴CO₂ อยู่ตลอดเวลา สภาพที่มีแสงแต่ไม่มี 14 CO₂ และในสภาพที่มี ¹⁴CO₂ แต่ไม่มีแสง แล้วนำไปเขียนกราฟ ขณะที่มีแสงสว่างของคาร์บอนไดออกไซด์นั้น เป็นสภาพที่เหมาะสมสำหรับการสังเคราะห์ด้วยแสง ปริมาณของ PGA และ RuBP จะอยู่ในระดับคงที่ ซึ่งอาจแปลความหมายได้ 2 กรณี คือกรณีแรกไม่มีการเปลี่ยนแปลงทั้งปริมาณของ PGA และ RuBP ส่วนกรณีที่ 2 อธบายได้ว่า PGA และ RuBP มีการเปลี่ยนแปลงปริมาณทั้งคู่ โดยปริมาณของ PGA และ RuBP ที่เปลี่ยนแปลงไปจะเท่ากับปริมาณของ PGA และ RuBP ที่เกิดขึ้นใหม่ในขณะที่ไม่มีแสงสว่าง แต่มีคาร์บอนไดออกไซด์ ปริมาณ PGA เพิ่มขึ้น ส่วน RuBP ลดลง อาจเป็นไปได้ว่า การสังเคราะห์และการสลาย PGA และ RuBP มีส่วนเกี่ยวข้องกันและยังเกี่ยวข้องกับแสงด้วย การที่ปริมาณ RuBP ลดลงในขณะที่ไม่มีแสง
เนื่องจากไม่เกิดปฏิกิริยาที่ใช้แสง จึงไม่มี ATP และ NADPH+H+ เพื่อใช้เปลี่ยน PGA ให้เป็น RuBP การเปลี่ยนแปลงของ PGA และ RuBP ในช่วงที่ไม่มี CO2 เป็นการสนับสนุนสมมติฐานที่ว่า RuBP อาจเป็นตัวรับคาร์บอนไดออกไซด์แล้วทำให้เกิด PGA ขึ้นมา เนื่องจากกราฟแสดงให้เห็นว่า เมื่อมีแสงและไม่มีคาร์บอนไดออกไซด์ ปริมาณ RuBP จะสูงขึ้นในขณะที่ PGA ลดลง แสดงว่าการขาดคาร์บอนไดออกไซด์ ทำให้ RuBP ไม่สามารถเปลี่ยนไปเป็น PGA ได้ มีแต่การสร้างRuBPอย่างเดียว ทำให้ปริมาณ RuBP เพิ่มขึ้นขณะที่ RuBP ไม่สามารถเปลี่ยนเป็น PGA ได้ มีแต่ PGA เปลี่ยนแปลงไปเป็นสารอื่น จึงทำให้ปริมาณ PGA ลดลง นั่นคือการที่ RuBP จะเปลี่ยนเป็นสารอื่นได้ จะต้องเกี่ยวข้องกับการรับคาร์บอนไดออกไซด์ในช่วงที่มีแสง แต่ไม่มีแก๊สคาร์บอนไดออกไซด์ PGA จะมีการเปลี่ยนแปลงให้เป็นสารอื่นได้ เพราะในช่วงนี้ RuBP จะไม่เปลี่ยนเป็น PGA เนื่องจากขาดคาร์บอนไดออกไซด์จึงทำให้ปริมาณ PGA ลดลง ความสัมพันธ์ระหว่าง RuBP และ PGAคือ ขณะที่ไม่มีแสงPGAถูกสร้างมาจาก RuBP เมื่อมีคาร์บอนไดออกไซด์อยู่ด้วย จึงเป็นการสนับสนุนสมมติฐานที่ว่า RuBP เป็นตัวรับคาร์บอนไดออกไซด์ และทำให้เกิดPGA ขึ้น (แต่ปฏิกิริยาก็สามารถเกิดขึ้นได้ในขณะมีแสงเพราะเป็นปฏิกิริยาที่ใช้ผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาที่ใช้แสง เอ็ม คัลวิน (Melvin Calvin) เอ. เบนสัน (Andrew A. Benson) กับคณะ อยู่ที่มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย ที่เบิร์กเลย์ได้ศึกษาและทดลองเกี่ยวกับปฏิกิริยาไม่ใช้แสง พบว่าปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นในช่วงนี้เกิดเป็นวัฏจักร ซึ่งเรียกชื่อวัฏจักรนี้ว่าวัฏจักรคับวิน (Calvin cycle) หรือ วัฏจักรของ คัลวิน-เบนสัน (Calvin-Benson cycle) หรือวัฏจักรพืช C3
วัฏจักรคัลวิน
วัฏจักรคัลวิน แบ่งออกเป็นขั้นที่สำคัญๆ 3 ขั้นคือ
ปฏิกิริยาขั้นที่ 1 เริ่มต้นจากสารตั้งต้นคือ RuBP ซึ่งเป็นน้ำตาลที่มีคาร์บอน 5 อะตอมและหมู่ฟอสเฟตหมู่ RuBP จะรวมตัวกับคาร์บอนไดออกไซด์ ได้เป็นสารประกอบใหม่ที่มีคาร์บอน 6 อะตอม สารที่เกิดขึ้นใหม่นี้เป็นสารไม่อยู่ตัว จะสลายไปเป็น PGA 2 โมเลกุล ซึ่ง 1 โมเลกุลของ PGA จะมีคาร์บอนอยู่ 3 อะตอม และฟอสเฟต 1 หมู่ ดังนั้น ถ้าเริ่มต้นจาก RuBP 6 โมเลกุล รวมตัวกับ CO2 6 โมเลกุล จะได้ PGA 12 โมเลกุล ดังสมการ

ปฏิกิริยาขั้นที่ 2 จะมีการเปลี่ยนแปลงจาก PGA จนได้ PGAL ( Phosphoglyceraldehyde) โดยได้รับอิเล็กตรอนจาก NADPH+ H+ และพลังงานจากการสลายตัวของ ATP ที่ได้จากปฏิกิริยาที่ใช้แสง PGAL 1 โมเลกุล จะประกอบด้วยคาร์บอน 3 อะตอมและฟอสเฟต 1 หมู่ ดังนั้นจาก PGA 12 โมเลกุลจะเปลี่ยนเป็น PGAL 12 โมเลกุล
ปฏิกิริยาขั้นที่ 3 PGAL ที่เกิดขึ้น 12 โมเลกุลนั้น จะเปลี่ยนแปลงต่อไปโดย 10 โมเลกุลของ PGAL จะเปลี่ยนไปเป็น RuBP 6 โมเลกุล ในการเปลี่ยนแปลงนี้จะต้องใช้พลังงานจากการสลายตัวของ ATP ที่ได้จากปฏิกิริยาใช้แสงและใช้หมู่ฟอสเฟตที่เกิดขึ้นจากการสลายตัวนี้อีก 2 หมู่ จึงเหลือหมู่ฟอสเฟตที่ได้จากการสลายตัวของ ATP เพียง 4 หมู่
ส่วนน PGAL อีก 2 โมเลกุล อาจจะนำไปใช้ในการหายใจ หรืออาจจะรวมเป็นน้ำตาลกลูโคส 1 โมเลกุล ดังนั้นผลผลิตสำคัญที่ได้จากปฏิกิริยาที่ไม่ใช้แสงคือ PGAL ซึ่งเซลล์จะนำไปใช้ประโยชน์ได้หลายทาง กล่าวคือ นำไปใช้สร้าง RuBP ซึ่งเป็นสารตั้งต้นในวัฏจักรของคัลวินกลับขึ้นมาใหม่ อีกทางหนึ่งนำไปใช้ในกระบวนการหายใจ โดยเข้าสู่ช่วงไกลโคลิซิส อีกทางหนึ่งถูกนำไปใช้สร้างน้ำตาลกลูโคส หรือสารประกอบที่มีโมเลกุลใหญ่ขึ้น เช่น น้ำตาลซูโครส แป้ง เซลลูโลส เพกติน และไขมัน เป็นต้น

วัฏจักรคัลวินแต่ละวัฏจักร ต้องใช้ CO2,H2O และ RuBP อย่างละ 1 โมเลกุล กับต้องใช้ 3ATP + 2NADPH+ H⁺  วัฏจักรคัลวิน ถ้าเกิด 3 รอบ จะเกิด PGAL 1 โมเลกุล หลุดออกจากวัฏจักร ต้องใช้ CO2,H2O และ RuBP อย่างละ 3 โมเลกุล กับต้องใช้ 9 ATP + 6NADPH + H+ ดังนั้นการสร้างน้ำตาลกลูโคส 1 โมเลกุล ต้องเกิด Calvin Cycle ถึง 6 วัฏจักร
2.4.3 การตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ของพืช C4

พืช C3 ท่อลำเลียงที่ใบ เซลล์ห่อหุ้มท่อลำเลียง หรือบันเดิลชีทเซลล์ (Bundle sheath cell) ไม่มีคลอโรพลาสต์ ตัวอย่างพืชกลุ่มนี้ได้แก่ ข้าวเจ้า ข้าวสาลี ถั่ว และพืชทั่วๆไปชนิดอื่นเกือบทุกชนิด การตรึงแก๊สคาร์บอนไดออกไซด์เกิดที่เนื้อเยื่อมีโซฟิลล์ โดยการรวมตัวกับ RuBP ในวัฏจักรคัลวิน แล้วได้สารประกอบPGA ซึ่งมีคาร์บอน 3 อะตอม แล้วเกิดการเปลี่ยนแปลงตามวัฏจักรต่อไปจนได้น้ำตาลชนิดต่างๆ
พืช C4 ได้แก่ พวกอ้อย ข้าวโพด อ้อย ข้าวฟ่าง บานไม่รู้โรย เซลล์ห่อหุ้มท่อลำเลียงมีคลอโรพลาสต์ มีการตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ถึง 2 หน โดยหนแรกเกิดการตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ที่เนื้อเยื่อมีโซฟิลล์โดยมีสารประกอบที่มีคาร์บอน 3 อะตอม คือ กรดฟอสโฟอีนอลไพรูวิก (phosphoenol pyruvic acid) หรือ PEP มารับ CO2 แล้วกลายเป็นสารประกอบที่มีคาร์บอน 4 อะตอม คือกรดออกซาโลแอซิติก (oxaloacetic acid) หรือ OAA ซึ่งถือว่าเป็นผลิตภัณฑ์ตัวแรกของพืชจึงเรียกพืชพวกนี้ว่า พืช C4 สารประกอบคาร์บอน 4 อะตอม (OAA) จะเปลี่ยนเป็นกรดมาลิก (malic acid) แล้วจะเคลื่อนเข้าสู่บันเดิลชีทเซลล์ แล้วปล่อย CO2 เข้าสู่ วัฏจักรคัลวิน ทำให้ปริมาณ CO2 ในบันเดิลชีทเซลล์ สูงอยู่ตลอดเวลา และไปรวมกับ RuBP จึงถือว่าเป็นการตรึง CO2 ครั้งที่ 2
การตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ในพืช C4 จะเกิดขึ้นได้รวดเร็วกว่าพืช C3 เพราะโดยทั่วไปในสภาพปกติแล้ว การตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ของพืชนั้น CO2 จะเข้ารวมกับ RuBP ในพืช C3  ที่มีโซฟิลล์ของใบประมาณ 70% แต่ในพืช C4 เมื่อตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ครั้งแรกในมีโซฟิลล์เซลล์แล้ว มีการส่งสารประกอบที่ได้ไปยังบันเดิลชีทเซลล์ ทำให้ CO2 ในบันเดิลชีทเซลล์สูงอยู่ตลอดเวลา ทำให้มีการรวมตัวของ CO2 กับ RuBP ของการตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ครั้งที่สองเกิดได้อย่างรวดเร็ว

2.4.4 การตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ของพืช CAM
พืชบางชนิดที่ขึ้นในเขตการกันดารน้ำ เช่น พืชในวงศ์ Crassulaceae จะมีกลไกการตรึงคาร์บอนไดออกไซด์แตกต่างไปจากวิธีการที่ได้กล่าวมาแล้ว ปากใบของพืชเหล่านี้จะเปิดในเวลากลางคืนและปิดในเวลากลางวัน ทั้งนี้เพื่อลดปัญหาการสูญเสียน้ำ ในเวลากลางคืนพืชจะดูดคาร์บอนไดออกไซด์เข้าไปเป็นจำนวนมากแล้วสร้างกรดอินทรีย์ขึ้น โดยวิธีการเช่นเดียวกับที่พบในพืช C₄-pathway ดังนั้น ในเวลากลางคืนปริมาณกรดในพืชจึงมีอยู่เป็นจำนวนมาก แต่จะลดลงในเวลากลางวันเพราะกรดจะถูกนำไปใช้โดยกระบวนการเมตาบอลิซึม กรดอินทรีย์ที่สะสมอยู่ในพืชนี้ส่วนใหญ่เป็น กรดมาลิก (malic acid) ซึ่งมีอยู่มากถึง 85% ของกรดทั้งหมด พืชที่มีการตรึงคาร์บอนไดออกไซด์โดยวิธีนี้เรียกว่า Crassulacean Acid Metabolism plants (CAN plant) ปัจจุบันมีการศึกษาพบว่าพืชพวก CAM นี้นอกเหนือจากพืชในสกุล Crassulaceae โดยมากเป็นพืชที่มีลักษณะอวบน้ำ (succulent plant) เช่น กระบองเพชร กล้วยไม้ และสับปะรด เป็นต้น
กลไกในการตรึงคาร์บอนไดออกไซด์แบบ CAM นี้ เริ่มต้นด้วยเวลากลางคืนปากใบของพืชจะเปิด คาร์บอนไดออกไวด์จะถูกดูดเข้ามาทำปฏิกิริยากับ PEP โดยอาศัยกิจกรรมของ PEPCase สารที่เกิดขึ้นจากการรวมตัวกันดังกล่าว คือ กรดออกซาลิก (Oxaloacetic acid หรือ OAA) จากนั้น OAA จะเปลี่ยนเป็นกรดมาลิก โดยอาศัยกิจกรรมของเอนไซม์มาเลตดีไฮโดรจีเนส (malate dehydrogenase) หลังจากนั้นกรดมาลิกก็จะสะสมอยู่ในเซลล์ตลอดช่วงความมืด เมื่อพืชไดรับแสงในวันรุ่งขึ้นกรดมาลิกจะถูกนำไปใช้ต่อไป
โดยอาศัยการทำงานของเอนไซม์มาลิก (malic enzyme) จะเปลี่ยนกรดมาลิกไปเป็นกรดไพรูวิก (pyruvic acid) และคาร์บอนไดออกไซด์ จากนั้นคาร์บอนไดออกไซด์จะทำปฏิกิริยากับ RuBP เพื่อสร้างแป้งและน้ำตาลต่อไป สำหรับกรดมาลิกที่เกิดขึ้นในเวลากลางคืนนั้นพืชจะสะสมไว้ในแวคิวโอล (vacuole) การที่พืชเก็บกรดนี้ไว้ในแวคิวโอลนับว่าเป็นผลดีต่อพืช เพราะกรดอินทรีย์ถ้ามีปริมาณมากเกินไปก็อาจเป็นอันตรายต่อพืชได้ ส่วนแป้งที่พืชสร้างขึ้นในเวลากลางวันพืชจะเก็บไว้ในคลอโรพลาสต์

2.5 โฟโตเรสไปเรชัน (Photorespiration) 
พืชมีการหายใจทั้งในเวลากลางวันวันและกลางคืน การที่พืชหายใจในเวลากลางวันจะมีผลทพำให้อัตราการสังเคราะหืด้วยแสงลดลง เพราะการหายใจและการสังเคราะห์ด้วยแสงเป็นกระบวนการของปฏิกิริยาย้อนกลับซึ่งกันและกัน ดังนั้นในการวัดอัตราการการสังเคราะห์ด้วยแสงที่แท้จริงจึไม่สามารถทำได้โดยง่าย ในปัจจุบันใช้วิธีการวัดอัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงที่ปรากฏ (apparent rate of photosynthesis) ซึ่งตามความหมายแล้วอัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงที่แท้จริงจะเท่ากับอัตราการสังเคราะห์ที่ปรากฏรวมกับอัตราการการหายใจตอนกลางวัน แท้จริงแล้วกระบวนการหายใจในตอนกลางวันกับการหายใจในตอนกลางคืนนั้นแตกต่างกันมาก เพื่อป้องกันไม่ให้เกิดเกิดการสับสนจึงมักเรียกการหายใจตอนกลางวันว่า โฟโตเรสไปเรชัน (photo respiration) และเรียกการหายใจตอนกลางคืนว่า ดาร์คเรสไปเรชัน (dark respiration) หรือ “การหายใจ”
จากการศึกษาของ เอ็น. อี ทอลเบริ์ต (N.E. Tolbert) แห่งมหาวิทยาลัยมิชิแกนสเตท สหรัฐอเมริกา พบว่า โฟโตเรสไปเรชันเกิดขึ้นมาจากเมทาบอลิซึมของ กรดไกลโคลิก (glycolic acid) ซึ่งเป็นสารที่เกิดขึ้นหลังจากการสังเคราะห์ด้วยแสง โดยเกิดจากการรวมตัวกันของ RuBP กับออกซิเจน โดยมีเอนไซม์ RuBP oxygenase เป็นตัวคะตะไลซ์ และจะมี 3-PGA เกิดขึ้นกับปฏิกิริยาด้วย ดังสมการ

                                                RuBP oxygenase

                        RuBP    +   O2                           glycolic acid + 3-PGA

ในการสังเคราะห์ด้วยแสงแบบ C₃–pathway นั้น RuBP จะรวมตัวกับคาร์บอนไดออกไซด์เกิดเป็น 3-PGA ขึ้นเพียงโมเลกุลเดียวเท่านั้น ดังนั้นพืชชนิดใดก็ตามที่มีโฟโตเรสไปเรชันเกิดขึ้นจะทำให้ RuBP เปลี่ยนไปเป็น 3-PGA ได้น้อยลง ซึ่งอาจเป็นสาเหตุสำคัญประการหนึ่งที่จะทำให้ประสิทธิภาพในการสังเคราะห์ด้วยแสงของพืชมีโฟโตเรสไปเรชันลดน้อยลง
เมทาบอลิซึมของ กรดไกลโคลิก เกี่ยวข้องกับออร์แกเนลล์ของเซลล์ 3 ชนิด คือ เพอรอกซีโซม (peroxysome)  คลอโรพลาสต์ และไมโตคอนเดรีย ซึ่งออร์แกเนลล์ของเซลล์เหล่านี้จะจะมีตำแหน่งที่อยู่ใกล้กันภายในเซลล์ การที่มีตำแหน่งที่ใกล้กันนี้ทำให้เกิดความสะดวกในแง่ของการเคลื่อนที่ของสารจากที่หนึ่งไปยังอีกที่หนึ่ง
ในปี พ.ศ. 2511 ทอลเบริ์ต ได้พบไมโครบอดี้ (microbodies) ต่อมาเรียกว่า เพอรอกซิโซม อยู่ในใบผักขมเป็นจำนวนมาก ภายในประกอบด้วยเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับเมทาบอลิซึมของกรดไกลโคลิก และพบว่าพืชที่มีโฟโตเรสไปเรชันจะมีเพอรอกซิโซมจำนวนมาก ส่วนพืชที่ไม่มีโฟโตเรสไปเรชันจะมีเพอรอกซิโซมจำนวนน้อยรวมทั้งมีกิจกรรมของ คะตาเลส (catalase) , ไกลโคเลตออกซิเดส (glycolate oxidase) อยู่ในระดับต่ำมาก ซึ่งขั้นตอนการเกิดโฟโตเรสไปเรชันนี้จะไม่มีการสร้างสารให้พลังงานสูง เช่น ATP หรือ NADH ผิดกับกระบวนการหายใจธรรมดาในปฏิกิริยามืดจะให้พลังงานเป็นจำนวนมาก ดังนั้นกระบวนการโฟโตเรสไปเรชันจึงเป็นกระบวนการที่ไม่ให้ประโยชน์กับพืช นอกจากนี้สารที่จะเข้าทำปฏิกิริยากับออกซิเจนยังเป็นสารชนิดเดียวกันกับสารที่เข้าทำปฏิกิริยากับคาร์บอนไดออกไซด์ในกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสง ดังนั้นพืชที่มีโฟโตเรสไปเรชันจึงทำให้ประสิทธิภาพในการสังเคราะห์ด้วยแสงของพืชนั้น ๆ ลดลง
ลักษณะของพืชที่ไม่มีโฟโตเรสไปเรชัน
พืชที่ไม่มีโฟโตเรสไปเรชันจะมีลักษณะทางกายวิภาคของใบแตกต่างจากพืชที่มีโฟโตเรสไปเรชัน โดยทั่วไปแล้วพืชที่ไม่มีโฟโตเรสไปเรชันจะเป็นพืช C₄ ส่วนพืชที่มีโฟโตเรสไปเรชันจะเป็นพืช C₃ ลักษณะของพืชที่ไม่มีโฟโตเรสไปเรชันมีดังนี้ คือ
1. ลักษณะใบมีเซลล์คลอเรนไคมา (chlorenchyma cell) จะรวมตัวกันอยู่รอบท่อน้ำท่ออาหารทำให้เกิดเป็นชั้นเรียกว่า บันเดิลซีท (bundle sheath) ซึ่งชั้นดังกล่าวนี้เซลล์จะเรียงตัวกันค่อนข้างหนาแน่น จึงไม่ทำให้เกิดช่องว่างระหว่างเซลล์หรือเกิดขึ้นเพียงเล็กน้อย นอกจากนี้แล้วคลอโรพลาสต์ที่อยู่ในบันเดิลซีทมักจะไม่มีกรานา (grana) โดยจะมีเพียงสายลาเมลลา (lamella) เท่านั้น
2. ประสิทธิภาพการสังเคราะห์ด้วยแสงสูง ในสภาพที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ปกติ (300 ppm) จะตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ได้ดีกว่าพืช C₃ ถึง 3 เท่า นอกจากนี้การเพิ่มความเข้มข้นของแสง (light intensity) จะทำให้ประสิทธิภาพการสังเคราะห์ด้วยแสงของพืช C₄ เพิ่มขึ้นเรื่อย ๆ แม้จะเพิ่มถึงความเข้มข้นเต็มที่ (full sunlight) ก็ตาม ซึ่งอาจกล่าวได้ว่าพืช C₄ ไม่มีการอิ่มแสง (light saturation) ในแง่ของอุณหภูมิพืช C₃ สามารถสังเคราะห์ด้วยแสงได้ดีที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส ส่วนในพืช C₄ สามารถสังเคราะห์ด้วยแสงได้ในช่วงอุณหภูมิ 30-45 องศาเซลเซียส ในช่วงดังกล่าวพืช C₄ สามารถสังเคราะห์ด้วยแสงได้เป็นสองเท่าของพืช C₃ ส่วนที่อุณหภูมิต่ำกว่า 20 องศาเซลเซียสลงไปประสิทธิภาพในการสังเคราะห์ด้วยของพืชทั้งสองชนิดไม่แตกต่างกัน จากการตอบสนองต่อแสง อุณหภูมิดังกล่าวจึงพบว่าพืช C₄ ส่วนมากมีถิ่นกำเนิดในเขตร้อนซึ่งมีอากาศร้อนและแห้งแล้ง ความเข้มข้นของแสงสูง ปริมาณน้ำมีน้อยในฤดูแล้ง
3. ไม่ตอบสนองต่อการเพิ่มออกซิเจน ในปี พ.ศ. 2472 นักชีวเคมีชาวเยอรมันชื่อ โอ. วอร์เบิร์ก (O. Warburg) พบว่าการเพิ่มปริมาณออกซิเจนให้สูงขึ้นจะทำให้การสังเคราะห์ด้วยแสงลดลง ต่อมาเรียกปรากฏการณ์นี้ว่า Warburg effect ต่อมามีการทดลองพบว่าการเพิ่มปริมาณออกซิเจนจาก 3-20 % จะทำให้ประสิทธิภาพการสังเคราะห์ด้วยแสงของพืช C₃ ลดลง แต่จะไม่กระทบต่อพืช C₄ 
4. การตอบสนองต่อคาร์บอนไดออกไซด์ (carbondioxide compensation point) ความสามารถของเอนไซม์ RuBPcase กับ PEP carboxylase (PEPCase) ที่จะทำให้สารขั้นต้นรวมตัวกับคาร์บอนไดออกไซด์ PEPCase สามารถทำให้สารขั้นต้นรวมตัวกับคาร์บอนไดออกไซด์ดีแม้ปริมาณคาร์บอนไดออกไซด์จะมีเพียงเล้กน้อยก็ตาม ส่วน RuBPcase มีความสามารถในการรวมตัวกับคาร์บอนไดออกไซด์ต่ำ จึงไม่สามารถคะตะไลซ์การรวมตัวระหว่างคาร์บอนไดออกไซด์กับสารขั้นต้นได้ ถ้ามากปริมาณคาร์บอนไดออกไซด์มีน้อยในพืช C₃ นั้นถ้าปริมาณคาร์บอนไดออกไซด์มีอยู่ 50 ppm จะไม่สามารถสังเคราะห์ด้วยแสงได้ จึงเรียกความเข้มข้นข้นของคาร์บอนไดออกไซด์ที่ทำให้อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงเป็นศูนย์นี้ว่า carbondioxide compensation point (ccp) ส่วนพืชC₄ สามารถสังเคราะห์ด้วยแสงได้แม้ว่าความเข้มข้นของคาร์บอนไดออกไซด์มีอยู่น้อย 1-2 ppm

2.6 ปัจจัยบางประการที่มีผลต่ออัตราการสังเคราะห์ด้วยแสง
2.6.1 ความเข้มของแสง (Light Intensity)
ถ้ามีความเข้มของแสงมาก อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงจะเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ
อุณหภูมิกับความเข้มของแสง มีผลต่ออัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงร่วมกัน คือ ถ้าอุณหภูมิสูงขึ้นเพียงอย่างเดียว แต่ความเข้มของแสงน้อยจะไม่ทำให้อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงเพิ่มขึ้น อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงจะเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ จนถึงขีดหนึ่งแล้วอัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงจะลดต่ำลงตามอุณหภูมิและความเข้มของแสงที่เพิ่มขึ้น โดยปกติ ถ้าไม่คิดถึงปัจจัยอื่นๆ เข้ามาเกี่ยวข้องด้วย อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงของพืชส่วนใหญ่จะเพิ่มมากขึ้น เมื่ออุณหภูมิสูงขึ้นในช่วง 0-35 C หรือ 0-40 C ถ้าอุณหภูมิสูงกว่านี้ อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงจะลดลง ทั้งนี้เนื่องจากกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสงเป็นปฏิกิริยาที่มีเอนไซม์ควบคุม และการทำงานของเอนไซม์ขึ้นอยู่กับอุณหภูมิ ดังนั้น เรื่องของอุณหภูมิจึงมีความสัมพันธ์กับอัตราการสังเคราะห์ด้วยแสง เรียกปฏิกิริยาเคมีที่มีความสัมพันธ์กับอุณหภูมิว่า ปฏิกิริยาเทอร์โมเคมิคัล ถ้าความเข้มของแสงน้อยมาก จนทำให้การสังเคราะห์ด้วยแสงของพืชเกิดขึ้นน้อยกว่ากระบวนการหายใจ น้ำตาลถูกใช้หมดไป พืชจะไม่สามารถมีชีวิตอยู่ได้ อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงของพืชไม่ได้ ขึ้นอยู่กับความเข้มของแสงเท่านั้น แต่ยังขึ้นอยู่กับความยาวคลื่น (คุณภาพ) ของแสง และช่วงเวลาที่ได้รับ เช่น ถ้าพืชได้รับแสงนานจะมีกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสงดีขึ้น แต่ถ้าพืชได้แสงที่มีความเข้มมากๆ ในเวลานานเกินไป จะทำให้กระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสงชะงัก หรือหยุดลงได้ทั้งนี้เพราะคลอโรฟิลล์ถูกกระตุ้นมากเกินไป ออกซิเจนที่เกิดขึ้นแทนที่จะออกสู่บรรยากาศภายนอก พืชกลับนำไปออกซิไดซ์ส่วนประกอบและสารอาหารต่างๆภายในเซลล์ รวมทั้งคลอฟิลล์ทำให้สีของคลอโรฟิลล์จางลง ประสิทธิภาพของคลอโรฟิลล์และเอนไซม์เสื่อมลง ทำให้การสร้างน้ำตาลลดลง 
2.6.2 ความเข้มข้นของ CO2 (Carbondioxide concentration)

หาความเข้มข้นของ CO2 เพิ่มขึ้นจากระดับปกติที่มีในอากาศ อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงจะเพิ่มสูงขึ้นตามไปด้วย จนถึงระดับหนึ่งถึงแม้ว่าความเข้มข้นของ CO2 จะสูงขึ้น แต่อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงไม่ได้สูงขึ้นตามไปด้วย และถ้าหากว่าพืชได้รับ CO2 ที่มีความเข้มข้นสูงกว่าระดับน้ำแล้วเป็นเวลานานๆ จะมีผลทำให้อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงลดต่ำลงได้
คาร์บอนไดออกไซด์ จะมีผลต่ออัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงมากน้อยแค่ไหนขึ้นอยู่กับปัจจัยอย่างอื่นด้วย เช่น ความเข้มข้นสูงขึ้น แต่ความเข้มของแสงน้อย และอุณหภูมิของอากาศก็ต่ำ กรณีเช่นนี้ อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงจะลดต่ำลงตามไปด้วย ในทางตรงกันข้าม ถ้า CO2 มีความเข้มข้นสูงขึ้น ความเข้มของแสงและอุณหภูมิของอากาศก็เพิ่มขึ้น กรณีเช่นนี้อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงก็จะสูงขึ้นตามไปด้วย นักชีววิทยาจึงมักเลี้ยงพืชบางชนิดไว้ในเรือนกระจกที่แสงผ่านเข้าได้มากๆ แล้วให้ CO2 มากขึ้นเป็นพิเศษ ซึ่งมีผลทำให้พืชมีกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสงเพิ่มมากขึ้น อาหารเกิดมากขึ้น จึงเจริญเติบโตอย่างรวดเร็ว ออกดอกออกผลเร็ว และออกดอกออกผลนอกฤดูกาลก็ได้
2.6.3 อุณหภูมิ (Temperature)
อุณหภูมิ เป็นปัจจัยอย่างหนึ่งที่มีอิทธิพลต่อการสังเคราะห์ด้วยแสงของพืช โดยทั่วไปอัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงจะเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ เมื่ออุณหภูมิสูงขึ้น 10-35 C ถ้าอุณหภูมิสูงขึ้นกว่านี้อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงจะลดต่ำลงตามอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้น อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงที่อุณหภูมิสูงๆ ยังขึ้นอยู่กับเวลาอีกปัจจัยหนึ่งด้วย กล่าวคือ ถ้าอุณหภูมิสูงคงที่ เช่น ที่ 40 C อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงจะลดลงตามระยะเวลาที่เพิ่มขึ้น ทั้งนี้เพราะเอนไซม์ทำงานได้ดีในช่วงอุณหภูมืพอเหมาะ ถ้าสูงเกิน 40 C เอนไซม์จะเสื่อมสภาพทำให้การทำงานของเอนไซม์ชะงักลง
2.6.4 ปัจจัยอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ด้วยแสง
ออกซิเจน (Oxygen)
ตามปกติในอากาศจะมีปริมาณของ O2 ประมาณ 25% ซึ่งมักคงที่อยู่แล้ว จึงไม่ค่อยมีผลต่อการสังเคราะห์ด้วยแสง แต่ถ้าปริมาณออกซิเจนลดลงจะมีผลทำให้อัตราการสังเคราะห์ด้วยแสงสูงขึ้น แต่ถ้ามีมากเกินไปจะทำให้เกิดปฏิกิริยาออกซิเดชัน ของสารต่างๆ ภายในเซลล์ โดยเป็นผลจากพลังงานแสง (Photorespiration) รุนแรงขึ้น การสังเคราะห์ด้วยแสงจึงลดลง
น้ำ (H2O)
น้ำ ถือเป็นวัตถุดิบที่จำเป็นต่อกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสง (แต่ต้องการประมาณ 1% เท่านั้น จึงไม่สำคัญมากนักเพราะพืชมีน้ำอยู่ภายในเซลล์อย่างเพียงพอ) อิทธิพลของน้ำมีผลต่อกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสงทางอ้อม คือ ช่วยกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์
เกลือแร่(Mineral Salt)

ธาตุ Mg และ N ของเกลือในดิน มีความสำคัญต่ออัตราการสังเคราะห์ด้วยแสง เพราะธาตุดังกล่าวเป็นองค์ประกอบอยู่ในโมเลกุลของคลอโรฟิลล์ ดังนั้น ถ้าในดินขาดธาตุทั้งสอง พืชก็จะขาดคลอโรฟิลล์ ทำให้การสังเคราะห์ด้วยแสงลดลงด้วย นอกจากนี้ยังพบว่า Fe จำเป็นต่อการสร้างคลอโรฟิลล์ และสารไซโตโครม (ตัวรับและถ่ายทอดอิเล็กตรอน) ถ้าไม่มีธาตุเหล็กในดินเพียงพอ การสังเคราะห์คลอโรฟิลล์ก็จะเกิดขึ้นไม่ได้
อายุของใบ
ใบจะต้องไม่แก่หรืออ่อนจนเกินไป ทั้งนี้เพราะในใบอ่อนคลอโรฟิลล์ยังเจริญไม่เต็มที่ ส่วนใบที่แก่มาก ๆ คลอโรฟิลล์จะสลายตัวไปเป็นจำนวนมาก